Die Oxidation von Fettsäuren organisiert mitochondriale Superkomplexe, um astrozytäre ROS und Kognition aufrechtzuerhalten

Naturstoffwechsel (2023)Diesen Artikel zitieren

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Durch den direkten Zugang zum Gehirngefäßsystem können Astrozyten verfügbare Blutnährstoffe aufnehmen und verstoffwechseln, um ihren eigenen Energiebedarf zu decken und Stoffwechselzwischenprodukte an lokale Synapsen zu liefern1,2. Diese Gliazellen sollten daher metabolisch anpassungsfähig sein, um verschiedene Substrate auszutauschen. In-vitro- und In-vivo-Studien zeigen jedoch durchweg, dass Astrozyten hauptsächlich glykolytisch sind3,4,5,6,7, was darauf hindeutet, dass Glukose ihr wichtigster Stoffwechselvorläufer ist. Insbesondere zeigen transkriptomische Daten8,9 und In-vitro-Studien10, dass Maus-Astrozyten in der Lage sind, Fettsäuren mitochondrial zu oxidieren und dass sie in Krankheitsmodellen überschüssige neuronale Fettsäuren entgiften können11,12. Der tatsächliche metabolische Vorteil der Fettsäurenutzung durch Astrozyten und ihre physiologische Auswirkung auf Gehirnfunktionen höherer Ordnung sind jedoch weiterhin unbekannt. Hier zeigen wir, dass der Ausfall von Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1A (CPT1A) – einem Schlüsselenzym der mitochondrialen Fettsäureoxidation – in Astrozyten erwachsener Mäuse zu kognitiven Beeinträchtigungen führt. Mechanistisch gesehen veränderte die verringerte Fettsäureoxidation den Pyruvatstoffwechsel in Astrozyten, um den Elektronenfluss durch eine superassemblierte mitochondriale Atmungskette zu erleichtern, was zu einer Abschwächung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führte. Daher metabolisieren Astrozyten auf natürliche Weise Fettsäuren, um die mitochondriale Atmungskette in einer energetisch ineffizienten zerlegten Konformation zu bewahren, die signalisierende reaktive Sauerstoffspezies sichert und die kognitive Leistungsfähigkeit aufrechterhält.

Um die Expressionsniveaus von Genen zu ermitteln, die für die Verwendung von Fettsäuren in Astrozyten und Neuronen kodieren, führten wir eine quantitative PCR mit Reverse-Transkriptionsanalysen (RT-qPCR) durch, die eine erhöhte Messenger-RNA-Häufigkeit in der Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1A (Cpt1a) – verantwortlich für – ergab langkettiger Acyl-CoA-Eintritt in Mitochondrien13 – und verringerte Acetyl-CoA-Carboxylase-1 (Acc1) – ​​verantwortlich für die Biosynthese der CPT1A−-Inhibitor-Malonyl-CoA14-mRNA-Häufigkeiten in primären Astrozyten der Maus im Vergleich zu Neuronen (ergänzende Abbildung 1a) . Darüber hinaus sind die mRNA-Häufigkeiten der mitochondrialen Acc2-Isoform, die in oxidativen Geweben wie Skelettmuskeln und Herzen stark angereichert vorkommt15, der langkettigen Acetyl-CoA-Dehydrogenase (Acadl), die den ersten Schritt der mitochondrialen Fettsäureoxidation katalysiert, von Es wurde festgestellt, dass das im endoplasmatischen Retikulum lokalisierte Cpt1c und das mitochondriale trifunktionale Protein α (Mtpα), das funktionell für den Elektronentransfer von mitochondrialen langkettigen Fettsäuren zu den mitochondrialen Atmungskomplexen I (CI) und III (CIII)16 verantwortlich ist, höher sind Astrozyten versus Neuronen (Ergänzende Abbildung 1a). Obwohl es sich hierbei um relative Werte handelt, stimmen sie mit früheren Beobachtungen8,9,10 überein, was darauf hindeutet, dass Astrozyten besser als Neuronen für die mitochondriale Oxidation langkettiger Fettsäuren gerüstet sind. Um diese Aussage funktionell zu untermauern, wurde die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in Astrozyten und Neuronen mithilfe der Seahorse-Technologie in einem glukosebasierten Medium in Abwesenheit oder Anwesenheit von Etomoxir analysiert: einem wirksamen und irreversiblen Inhibitor von CPT1 (Lit. 17). Wie in der ergänzenden Abbildung 1b gezeigt, war die basale Mitochondrienatmung bei Neuronen im Vergleich zu Astrozyten etwa 1,7-fach höher, was frühere Ergebnisse bestätigt18. Bemerkenswert ist, dass der Anteil der mitochondrialen OCR-Hemmung durch Etomoxir bei Neuronen etwa 20 % und bei Astrozyten etwa 35 % betrug (ergänzende Abbildung 1b), was darauf hinweist, dass Fettsäuren für Astrozyten bevorzugte mitochondriale Atmungssubstrate sind als für Neuronen. Ungefähr 62 % der ATP-verknüpften mitochondrialen Atmung der Astrozyten wurden durch Fettsäuren aufrechterhalten (ergänzende Abbildung 1b).

Um den metabolischen Vorteil der mitochondrialen Fettsäureoxidation in Astrozyten in vivo zu untersuchen und ansonsten die potenziellen Nachteile pharmakologischer Inhibitoren zu überwinden, haben wir ein Astrozyten-spezifisches Cpt1a-Knockout-Mausmodell (KO) gentechnisch verändert. Zu diesem Zweck wurden zwei Monate alten Cpt1alox/lox-Mäusen19 intravenös über den retroorbitalen Sinus20 Partikel des Adeno-assoziierten Virus (AAV) vom Serotyp PHP.eB injiziert, die Cre-Rekombinase exprimieren, die durch die astrozytenspezifische Glia-Fibrillen-Säure gesteuert wird Protein (GFAP) Kurzpromotor (PHP.eB-AAV-gfaABC1D-Cre-GFP) (Abb. 1a). Diese Behandlung war effizient, gemessen an der breiten Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) im gesamten Gehirn (ergänzende Abbildung 1c). Die Kontrollen (Wildtyp, WT) waren Cpt1alox/lox-Mäuse, die äquivalente Dosen der gleichen Viruspartikel erhielten, außer dass ihnen Cre-Rekombinase fehlte, und alle Mäuse wurden nach 1–9 Monaten analysiert (Abb. 1a). Wie in Abb. 1b (ergänzende Abb. 1d) gezeigt, verursachte die Behandlung mit PHP.eB-AAV-gfaABC1D-Cre-GFP eine signifikante Verringerung der CPT1A-Proteinhäufigkeit im Gehirn. Da das Gehirn neben Astrozyten auch andere Zelltypen enthält, analysierten wir auch die CPT1A-Häufigkeit in Ex-vivo-Astrozyten, die immunomagnetisch aus dem Gehirn erwachsener CPT1A-KO-Mäuse isoliert wurden (Abb. 1a), was eine Abschaffung von CPT1A speziell bei Astrozyten-positiven (ACSA+) zeigte. Fraktion, jedoch nicht in der Astrozyten-negativen (ACSA−) Fraktion (Abb. 1c). Um die funktionelle Wirksamkeit von CPT1A KO zu ermitteln, wurden ex vivo frisch isolierte Hirnschnitte von erwachsenen Mäusen mit [U-14C]Palmitinsäure inkubiert, um die Geschwindigkeit der 14CO2-Produktion als Index für den Fettsäureoxidationsfluss zu bestimmen. Wie in Abb. 1d gezeigt, war der Oxidationsfluss im Gehirn bei CPT1A KO im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant um etwa 75 % reduziert. Um zu erklären, ob der Verlust von astrozytischem CPT1A andere Wege des Gehirnstoffwechsels verändert, führten wir ungezielte Metabolomikanalysen in Gehirnproben durch. Wie im Vulkandiagramm (ergänzende Abbildung 1e) und in der Heatmap (ergänzende Abbildung 1f) dargestellt, stellten wir fest, dass im Gehirn der Astrozyten-spezifischen CPT1A-KO-Mäuse 17 Metaboliten signifikant abnahmen und 43 Metaboliten signifikant anstiegen. Die Ergebnisse zeigten eine erhöhte Häufigkeit langkettiger Fettsäuren und langkettiger Acyl-Carnitin-Derivate sowie eine verringerte Häufigkeit kurzkettiger Fettsäuren (Abb. 1e), was auf eine verringerte Verwendung langkettiger und eine erhöhte Verwendung kurzkettiger Fettsäuren schließen lässt. Bemerkenswerterweise war die Pyruvatkonzentration im Gehirn von Astrozyten-spezifischen CPT1A-KO-Mäusen signifikant um etwa 26 % verringert (Abb. 1e), was auf eine Veränderung im Metabolismus dieses glykolytischen Endproduktzwischenprodukts hindeutet.

a: Strategie zur Erzeugung astrozytenspezifischer Cpt1a-KO-Mäuse und zur immunmagnetischen Reinigung von CPT1A-KO-Astrozyten aus erwachsenem Gehirn. Erstellt mit BioRender.com. b: Western Blot gegen CPT1A-Protein im Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Gehirn. β-Tubulin wurde als Beladungskontrolle verwendet; n = 2 Mäuse pro Bedingung (Ergänzende Abbildung 1d). c, Western Blot gegen CPT1A-Protein in ACSA+-Zellen (Astrozyten) und ACSA−-Zellen (keine Astrozyten), immunomagnetisch isoliert aus astrozytenspezifischem Cpt1a-KO-Maushirn; n = 2 Mäuse pro Bedingung. GFAP wurde als Astrozytenanreicherungs- und Beladungskontrolle verwendet. d, Rate der 14CO2-Produktion aus [U-14C]Palmitinsäure in Hirnschnitten von WT- und Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Der P-Wert ist angegeben (n = 3 biologisch unabhängige Proben; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). e, Konzentrationen einer Auswahl von Metaboliten, die in der Metabolomics-Studie der Gehirnproben von Astrozyten-spezifischem Cpt1a KO im Vergleich zu WT-Mäusen verändert wurden. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 6 Mäuse pro Bedingung; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). au, beliebige Einheiten.

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Als nächstes wollten wir die metabolischen CPT1A-KO-Astrozyten weiter charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden Astrozyten in Primärkulturen von Cpt1alox/lox-Mäusen mit Adenoviren transduziert, die Cre-Rekombinase unter dem potenten Cytomegalievirus (CMV)-Promotor (AdV-CMV-Cre-GFP) exprimierten (Abb. 2a). Als Kontrollen (WT) wurden Cpt1alox/lox-Astrozyten verwendet, die mit AdV ohne Cre-Rekombinase (AdV-CMV-GFP) transduziert wurden. Die RT-qPCR-Analyse ergab, dass die mRNAs von Cpt1a, nicht von Cpt1b oder Cpt1c, in AdV-CMV-Cre-GFP-transduzierten Astrozyten abnehmen (ergänzende Abbildung 2a). Wie in Abb. 2b (ergänzende Abb. 2a) gezeigt, wurde das CPT1A-Protein in AdV-CMV-Cre-GFP-transduzierten Astrozyten im Vergleich zu WT-Zellen effizient ausgeschaltet. Die Proteinhäufigkeit von CPT1B, CPT1C und CPT2 blieb davon unberührt (ergänzende Abbildung 2c). Die Freisetzung von 3-Hydroxybutyrat aus AdV-CMV-Cre-GFP-transduzierten Astrozyten war signifikant verringert, was auf eine beeinträchtigte Ketogenese in CPT1A-KO-Astrozyten schließen lässt (ergänzende Abbildung 2d). Wir haben außerdem die Rate der Umwandlung von [1-14C]Palmitinsäure in 14CO2 und 14C-Ketone untersucht, die bei CPT1A KO im Vergleich zu WT-Astrozyten um etwa 50 % reduziert war (Abb. 2c, d und ergänzende Abb. 2e). Etomoxir, das sowohl die durch CPT1 (mitochondrial) als auch durch Carnitin-Octanoyltransferase (peroxisomal) vermittelte Fettsäureaufnahme hemmt, hat die [U-14C]-Palmitinsäureoxidation praktisch aufgehoben (ergänzende Abbildung 2f). Daher dürfte die Zusammenarbeit eines zellulären Kompartiments, wahrscheinlich des Peroxisoms22, das nicht von CPT1A abhängt, durch die Umwandlung langkettiger in kurzkettige Fettsäuren zur mitochondrialen Oxidation von Fettsäuren beitragen. Da davon ausgegangen wird, dass der Energiestoffwechsel der Astrozyten größtenteils durch die Glykolyse 3,4,5 aufrechterhalten wird, wollten wir als nächstes den Einfluss der Fettsäureoxidation auf den Glukosestoffwechsel untersuchen. Dazu analysierten wir zunächst die Geschwindigkeit der [6-14C]Glucoseoxidation zu 14CO2, einem Prozess, der im Tricarbonsäurezyklus (TCA) stattfindet. Wie in Abb. 2e gezeigt, nahm die Decarboxylierung von [6-14C]Glucose in CPT1A-KO-Astrozyten zu. 14C6-Glucose markiert durch Glykolyse 14C3-Pyruvat, das abhängig von der Glykolyserate, dem mitochondrialen Pyruvatimport und der Pyruvatdehydrogenase (PDH)-Aktivität ausschließlich im TCA-Zyklus decarboxyliert. Um herauszufinden, welcher dieser Schritte für die erhöhte Rate der [6-14C]Glucose-Decarboxylierung verantwortlich ist, haben wir die [1-14C]Pyruvat-Decarboxylierung, die ausschließlich bei PDH stattfindet, nach dem Import von mitochondrialem Pyruvat untersucht. Wir fanden einen signifikanten Anstieg der 14CO2-Bildung aus [1-14C]Pyruvat in CPT1-KO-Astrozyten (Abb. 2f), was auf eine erhöhte PDH-Decarboxylierungsrate hinweist. Dies wurde durch die Bewertung des 293Ser-Phosphorylierungsstatus der PDH-A1-Untereinheit (PDHA1) bestätigt, der reduziert war (ergänzende Abbildung 2g), was auf eine PDH-Aktivierung 23 hinweist, ein Ende, das durch die PDH-spezifische Aktivität bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 2h). Dieses Ergebnis, das die beobachtete Verringerung der Pyruvatkonzentration in der Metabolomics-Analyse erklärt (Abb. 1e), weist darauf hin, dass Astrozyten bei Cpt1a-Verlust eine metabolische Neuverdrahtung durchlaufen, die in einer verstärkten Pyruvat-Decarboxylierung zu Acetyl-Coenzym A besteht. Laktat ist das wichtigste Stoffwechselschicksal von glykolytisch gewonnenem Pyruvat in Astrozyten3,4,5. Wir untersuchten daher, ob die verstärkte mitochondriale Pyruvat-Decarboxylierung das von Astrozyten freigesetzte Laktat veränderte. Wie in Abb. 2g gezeigt, wurde die Laktatbildung um einen Anteil (ungefähr 118 nmol h-1 mg Protein-1) reduziert, der mit einer erhöhten Pyruvat-Decarboxylierung (ungefähr 65 nmol h-1 mg Protein-1) übereinstimmt (Abb. 2f). CPT1A-KO-Astrozyten, ein Effekt, der nicht durch Änderungen im Fluss der Glykolyse erklärt werden konnte, der speziell anhand der Geschwindigkeit der Umwandlung von [3-3H]Glucose in 3H2O gemessen wurde (Abb. 2h). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Astrozyten bei Cpt1a KO das metabolische Schicksal von Pyruvat neu verknüpfen, um dessen mitochondriale Oxidation zu erhöhen, ohne die Glykolyse zu beeinträchtigen. Glykolyse und β-Oxidation scheinen daher unabhängig voneinander regulierte Wege zu sein, die darauf abzielen, verschiedene Facetten des Astrozytenstoffwechsels aufrechtzuerhalten.

a: Strategie zur Gewinnung von Cpt1a-KO-Astrozyten in Astrozyten in der Primärkultur. Erstellt mit BioRender.com. b, Western Blot gegen CPT1A-Protein in Cpt1a-KO-Astrozyten in Primärkultur 5 Tage nach der AdV-CMV-Cre-GFP-Transduktion; n = 3 biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig. β-Actin wurde als Ladungskontrolle verwendet (ergänzende Abbildung 2b). c, 14CO2-Produktion aus [1-14C]Palmitinsäure in WT- und Cpt1a-KO-Astrozyten in Primärkultur. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Der P-Wert ist angegeben (n = 4 biologisch unabhängige Proben; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). d, 14Ketone-Produktion aus [1-14C]Palmitinsäure in WT- und Cpt1a-KO-Astrozyten in Primärkultur. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Der P-Wert ist angegeben (n = 4 biologisch unabhängige Proben; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). e–h, 14CO2-Produktion aus [6-14C]Glucose (e) oder [1-14C]Brenztraubensäure (f), Rate der freigesetzten Laktate (g) und glykolytischer Fluss, gemessen anhand der Rate von [3-3H]Glucose Umwandlung in 3H2O (h), in WT- und Cpt1a-KO-Astrozyten in Primärkultur. TPI, Triosephosphat-Isomerase. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben; n = 6 (e), 6 (f), 8 (g) und 6 (h) biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; gepaarter Student-t-Test, zweiseitig. i, OCR-Analyse und berechnete Parameter in WT- und Cpt1a-KO-Astrozyten in Primärkultur. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 5 biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; ungepaarter Student-T-Test, zweiseitig) (Ergänzende Abbildung 2j, k).

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Angesichts des Beitrags der Fettsäureoxidation zur Aufrechterhaltung der mitochondrialen Atmung von Astrozyten (ergänzende Abbildung 1b) analysierten wir als nächstes die OCR in CPT1A-KO-Astrozyten. Wie in Abb. 2i gezeigt, erhöhte sich der Verlust von CPT1A um etwa das 1,5-fache der mitochondrialen Basal- und ATP-verknüpften Atmung, ohne die maximale und nicht-mitochondriale Atmung statistisch signifikant zu beeinflussen. Diese Ergebnisse stehen offenbar im Gegensatz zu denen, die eine verminderte basale Mitochondrienatmung durch Etomoxir zeigen (ergänzende Abbildung 1b). Allerdings hemmt Etomoxir CPT1 akut, wohingegen der genetische Mangel an Cpt1a es Astrozyten ermöglicht, sich an den CPT1A-Verlust anzupassen. Somit scheint ein Mangel an CPT1A den Stoffwechsel der Astrozyten in eine Konformation umzuprogrammieren, bei der die mitochondriale Atmung verbessert wird. Eine solche Verbesserung ist laut Proteinhäufigkeitsparametern nicht die Folge einer erhöhten mitochondrialen Masse (ergänzende Abbildung 2i). Angesichts der Tatsache, dass der Elektronenfluss durch mitochondriales CI der energetisch effizienteste Weg zur Erhaltung mitochondrialer Energie ist, haben wir den Anteil der mitochondrialen Atmung analysiert, der von diesem Komplex beigetragen wird. Zu diesem Zweck inhibierten wir die mitochondriale Atmung mit dem CI-spezifischen Inhibitor Rotenon, sowohl in intakten (ergänzende Abbildung 2j) als auch in Digitonin-permeabilisierten Zellen in Gegenwart von CI-Substraten und ADP (ergänzende Abbildung 2k), was zeigte, dass die Der Beitrag von CI zur Aufrechterhaltung der mitochondrialen Atmung war bei CPT1A-KO-Astrozyten im Vergleich zu WT-Astrozyten signifikant erhöht. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die mitochondriale Oxidation endogener Fettsäuren in Astrozyten die Konformation der mitochondrialen Atmungskette in einem energetisch weniger aktiven Modus erhält.

Um den molekularen Mechanismus zu verstehen, durch den die Fettsäureoxidation die mitochondriale Atmung in Astrozyten weniger aktiv hält, wollten wir die Superanordnung der Atmungskomplexe untersuchen, von denen angenommen wird, dass sie die mitochondriale Atmung regulieren24,25,26. Zu diesem Zweck wurden Mitochondrien aus CPT1A KO- und WT-Astrozyten isoliert und ihre Proteine ​​einer blauen nativen Gelelektrophorese (BNGE) unterzogen, gefolgt von Western Blot gegen CI-, CIII- und CIV-Untereinheiten. Die Analyse ergab, dass der Verlust von CPT1A zu einem signifikanten Anstieg der Bildung von mitochondrialen Superkomplexen (SC) führte (Abb. 3a, b und ergänzende Abb. 3a), was wahrscheinlich den beobachteten Anstieg der CI-unterstützten Atmung erklärt (ergänzende Abb. 2j, k). Die erhöhte SC-Bildung und die CI-anhaltende Atmung konnten weder auf eine mutmaßliche Erhöhung der Proteinhäufigkeit der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe (ergänzende Abbildung 3b) noch auf eine Erhöhung der CI-spezifischen Aktivität (ergänzende Abbildung 3c) zurückgeführt werden. Die CI-III- und CIV-spezifischen Aktivitäten stiegen in CPT1A-KO-Astrozyten signifikant an (ergänzende Abb. 3c), was mit einer verstärkten Mitochondrienatmung (Abb. 2i) und SC-Bildung (Abb. 3a, b und ergänzende Abb. 3a) zusammenhängt. Auch wenn dies umstritten ist25,26, wurde vermutet, dass die CI-Superassemblierung in SC neben der Regulierung der Atmung auch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im Herzen27 und in Gehirnzellen, einschließlich Neuronen und Astrozyten, reguliert18. Dementsprechend untersuchten wir als nächstes, ob die beobachtete Superassemblierung der mitochondrialen Atmungskette in CPT1A-KO-Astrozyten einen Einfluss auf die ROS-Häufigkeit hatte. Wie in Abb. 3c gezeigt, war Wasserstoffperoxid (H2O2) in CPT1A-KO-Astrozyten signifikant niedriger. Um einen Kausalzusammenhang zwischen erhöhter SC-Bildung und verringerter H2O2-Erzeugung in CPT1A-KO-Astrozyten herzustellen, haben wir die CI-Untereinheit NDUFS1 ausgeschaltet (ergänzende Abbildung 3d), eine Strategie, die zuvor zur Reduzierung der CI-Spiegel verwendet wurde . Diese Behandlung verursachte eine Zerlegung von CI-haltigem SC in Astrozyten (ergänzende Abbildung 3e) und verhinderte den Anstieg der mitochondrialen Basalatmung (Abbildung 3e), ohne die maximale, ATP-gebundene und nicht-mitochondriale Atmung statistisch signifikant zu beeinflussen (ergänzende Abbildung 3f). und erhöhtes H2O2 in den CPT1A-KO-Astrozyten (Abb. 3f). Während zur Bestätigung dieses Mechanismus 25 Strukturarbeiten mit höherer Auflösung erforderlich wären, deuten diese Daten insgesamt darauf hin, dass die Fettsäureoxidation die mitochondriale Atmungskette der Astrozyten in einer energetisch weniger günstigen Strukturkonformation hält, die die ROS-Erzeugung aufrechterhalten kann.

a, Freies CI und CI-haltige SCs (SC-CI) in primären WT- und Cpt1a-KO-Astrozyten, analysiert durch BNGE, gefolgt von Immunblotting gegen die CI-Untereinheit NDUFA9. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 3 biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). b: Freies CIII und CIII-haltige SCs (SC-CIII) in primären WT- und Cpt1a-KO-Astrozyten, analysiert durch BNGE, gefolgt von Immunblotting gegen die CIII-Untereinheit UQCRC2. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 3 biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). c, H2O2-Produktion in WT- und CPT1A-KO-Astrozyten in Primärkultur. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 6 unabhängige Zellkulturpräparate; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). d, OCR-Analyse in WT- und Cpt1a-KO-Astrozyten in Primärkultur, entweder transfiziert mit durcheinandergemischten (Kontrolle) oder NDUFS1-siRNAs. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 4 biologisch unabhängige Zellkulturpräparate) (ergänzende Abbildung 3f). e, Basalatmung in WT- und CPT1A-KO-Astrozyten in Primärkultur, entweder transfiziert mit durcheinandergemischten (Kontrolle) oder NDUFS1-siRNAs. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 4 biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukey). f, H2O2-Produktion durch WT- und CPTA1A-KO-Astrozyten in Primärkultur, entweder transfiziert mit durcheinandergemischten (Kontrolle) oder NDUFS1-siRNAs. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 3 biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; mehrfacher ungepaarter Student-t-Test). g: Strategie zur Bewertung der Wirkung von Cpt1a-KO-Astrozyten auf WT- oder mCAT-Neuronen in der Primärkultur. Erstellt mit BioRender.com. h–l, Glutathionkonzentration (h), mitochondriale ROS (i), ∆ψm (j), Apoptose (k) und c-Fos- und Arc-mRNA-Häufigkeit (l) in WT- oder mCAT-exprimierenden transgenen Neuronen nach Kokultur mit WT oder Cpt1a KO-Astrozyten; n = 3 (h), 4 (i), 4 (j), 4 (k, WT), 4 (k, mitoCAT) und 4 (l) biologisch unabhängige Zellkulturpräparate; gepaarter Student-t-Test, zweiseitig für einfache Vergleiche und zweiseitige ANOVA gefolgt von Tukey für mehrere Vergleiche.

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Astrozyten-ROS stellen Redoxsignale dar, die den Gehirnstoffwechsel modulieren, um das Verhalten der Maus aufrechtzuerhalten28. Darüber hinaus sind Astrozyten in der Lage, Fettsäuren in Ketonkörper umzuwandeln 10, 29, 30 (Abb. 2d und ergänzende Abb. 2d), die laut an Drosophila durchgeführten Studien zur oxidativen Verwendung zu Neuronen transportiert werden können 31, 32. Darüber hinaus zeigen wir hier, dass Pyruvat in Laktat umgewandelt wird, solange Astrozyten Fettsäuren oxidieren, einen Metaboliten, der auch zu Neuronen transportiert werden kann33,34. Angesichts der Tatsache, dass das Ausschalten von Cpt1a in Astrozyten die ROS-Erzeugung beeinträchtigte, die physiologisch die neuronale Integrität und die Wahrnehmung der Maus aufrechterhält, untersuchten wir als Nächstes die Auswirkungen auf die neuronale Funktion und das neuronale Verhalten. Mit CPT1A-KO-Astrozyten kokultivierte Neuronen (Abb. 3g) erlitten im Einklang mit früheren Beobachtungen einen Verlust an antioxidativem Glutathion (Abb. 3h), was auf neuronalen Redoxstress schließen lässt. Tatsächlich zeigten diese Neuronen einen erhöhten mitochondrialen ROS (Abb. 3i), eine Störung des mitochondrialen Membranpotentials (∆ψm) (Abb. 3j) und einen apoptotischen Tod (Abb. 3k). Neuronen, die eine mitochondriale Isoform des antioxidativen Enzyms Katalase (mitochondriale Katalase (mCAT)-Neuronen) exprimieren, die den durch die Koinkubation mit CPT1A-Astrozyten verursachten erhöhten mitochondrialen ROS wirksam verhindert (Abb. 3i), den ∆ψm-Verlust und die Apoptose beseitigt (Abb. 3j, k). ). Diese bioenergetischen Veränderungen verursachten eine neuronale Dysfunktion, was anhand der verringerten mRNA-Häufigkeiten der neuronalen Funktionsmarker c-Fos und Arc in mitochondrialer ROS-abhängiger Weise beurteilt wurde (Abb. 3l). Um die In-vivo-Auswirkungen unserer Ergebnisse festzustellen, isolierten wir immunmagnetisch Astrozyten sowohl aus WT- als auch aus Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen (Abb. 4a). Die Charakterisierung neuronaler Zellmarker bestätigte die Reinheit der ACSA+-Fraktion (Astrozyten) in beiden Genotypen (ergänzende Abbildung 4a). Die Analyse der mitochondrialen Atmungskette SC in den mitochondrialen Fraktionen dieser Zellen ergab, dass der Verlust von CPT1A die SC-Bildung erhöhte, ein Effekt, der sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 4b). Die immunomagnetische Isolierung von Neuronen aus Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen (Abb. 4a), die gemäß den neuralen Zellmarkern (ergänzende Abb. 4a) zu einer angereicherten Fraktion (Neuron+) führte, gefolgt von einer SC-Analyse ihrer mitochondrialen Fraktionen, ergab CI Demontage von SC sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen (ergänzende Abbildung 4c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Verlust von CPT1A in Astrozyten eine mitochondriale Dysfunktion in benachbarten Neuronen verursacht. In guter Übereinstimmung mit den in primär kultivierten Astrozyten erhaltenen Daten zeigten Astrozyten, die aus erwachsenen Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen isoliert wurden, eine erhöhte Basal- und ATP-verknüpfte Atmung (Abb. 4b und ergänzende Abb. 4d), vermindertes H2O2 und mitochondriale ROS (Abb. 4c). ) mit unverändertem ∆ψm (ergänzende Abbildung 4e) im Vergleich zu denen, die aus WT-Mäusen isoliert wurden. Neuronen, die aus erwachsenen Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen isoliert wurden, zeigten eine verminderte Basal- und ATP-verknüpfte Atmung (Abb. 4b und ergänzende Abb. 4d), erhöhte H2O2- und mitochondriale ROS (Abb. 4c) mit verringertem ∆ψm (ergänzende Abb. 4e). im Vergleich zu denen, die aus WT-Mäusen isoliert wurden. Daher entwickeln Neuronen neben CPT1A-KO-Astrozyten adaptive Veränderungen, die zu mitochondrialer Dysfunktion und Redoxstress führen. Um zu beurteilen, ob die beobachteten Auswirkungen auf Neuronen Auswirkungen auf das Verhalten haben, wurden Mäuse einer Reihe von Leistungstests unterzogen. Die Ergebnisse zeigten, dass Astrozyten-spezifische Cpt1a-KO-Mäuse keine signifikante Beeinträchtigung der Freilandleistung (ergänzende Abbildung 5a) oder des Rotarod-Tests (ergänzende Abbildung 5b) entwickelten, was auf einen Mangel an Angstzuständen und motorischer Koordination hinweist. Astrozytenspezifische Cpt1a-KO-Mäuse zeigten jedoch eine Beeinträchtigung des Arbeitsgedächtnisses, was anhand des beobachteten verringerten Diskriminierungsindex im neuartigen Objekterkennungstest (Abb. 4d und ergänzende Abb. 5c) beurteilt wurde, sowie eine Beeinträchtigung des Langzeitgedächtnisses. Begriff räumliches Gedächtnis gemäß dem Barnes-Labyrinthtest (Abb. 4e und ergänzende Abb. 5d). Wenn auch über einen anderen Mechanismus, erfolgt ein ähnlicher Output bei der neuronenspezifischen genetischen Ablation der Cpt1c-Isoform37. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Oxidation von Fettsäuren in Astrozyten für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen ROS-Bildung, der neuronalen Energiefitness und der kognitiven Leistung bei Mäusen unerlässlich ist.

a: Strategie zur immunmagnetischen Isolierung von Astrozyten und Neuronen aus erwachsenen WT- oder Astrozyten-spezifischen CPT1A-KO-Mäusen. Erstellt mit BioRender.com. b, OCR-Analyse und berechnete Basalatmung in immunomagnetisch isolierten Astrozyten (oben) und Neuronen (unten) von WT- und Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 4 Mäuse pro Genotyp; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). c-, H2O2- und mitochondriale ROS-Analysen in immunomagnetisch isolierten Astrozyten (oben) und Neuronen (unten) von WT- und Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 5 Mäuse pro Genotyp; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). d, Neuartiger Objekterkennungstest in WT- und Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen. Es werden repräsentative Pfade und räumlich-zeitliche quantitative Heatmaps angezeigt. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 9 (WT) oder 7 (CPT1A KO) Mäuse; ungepaarter Student-t-Test, zweiseitig). e, Barnes-Labyrinthtest in WT- und Astrozyten-spezifischen Cpt1a-KO-Mäusen 8 Tage nach dem Training. Es werden räumlich-zeitliche quantitative Heatmaps angezeigt. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. P-Werte sind angegeben (n = 9 (WT) oder 7 (CPT1A KO) Mäuse; Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukey). P-Werte in der Abbildung.

Quelldaten

Zusammenfassend beschreiben wir hier, dass die mitochondriale Oxidation von Fettsäuren in Astrozyten signalisierende und zerebrale Vorteile höherer Ordnung aufweist. Dies wird vor allem durch die Erkenntnisse gestützt, dass die astrozytenspezifische genetische Deletion eines Schlüsselschritts bei der Fettsäureverwendung, CPT1A, die physiologische Produktion von signalisierenden mitochondrialen ROS beeinträchtigt. Im Gegensatz zum Glukosekatabolismus, der über die Pyruvatoxidation hauptsächlich Reduktionsäquivalente als NADH(H+) konserviert, konserviert die Fettsäure-β-Oxidation sowohl NADH(H+) als auch FADH2. Bemerkenswert ist, dass in Astrozyten der größte Teil des aus Fettsäuren gewonnenen Acetyl-Coenzyms A in Ketonkörper10 statt in den NADH(H+)-erzeugenden TCA-Zyklus umgewandelt wird, wodurch der relative Beitrag des aus Fettsäuren gewonnenen FADH2 zum Elektronenfluss zu CIII durch Elektronenübertragung verstärkt wird -Ubichinonoxidoreduktase. In Übereinstimmung damit ist die relative mRNA-Expression von Acadl und Mtpα, die für den Elektronentransfer langkettiger Fettsäuren auf CIII verantwortlich sind (Lit. 16), in Astrozyten hoch. Im Gegensatz dazu passt eine Beeinträchtigung der Fettsäureoxidation durch CPT1A-Verlust den Astrozytenstoffwechsel in Richtung einer erhöhten Pyruvat-Mitochondrienoxidation, CI-Assemblierung in SC und Mitochondrienatmung an. Dieser Mechanismus steht im Einklang mit dem kürzlich vorgeschlagenen Modell23, dass die PDH-Aktivität mit der funktionellen Organisation der mitochondrialen Atmungskette konvergiert, um optimale Stoffwechselanpassungen zu gewährleisten. Unsere Daten bestätigen auch18, dass die mitochondriale Atmungskette in Astrozyten in einer Konformation organisiert ist, in der CI nicht vollständig in SC zusammengesetzt ist, was es Fettsäuren ermöglicht, über die elektronenübertragende Ubichinonoxidoreduktase zur mitochondrialen Atmung beizutragen. Obwohl bekannt ist, dass dieser Weg energetisch weniger effizient ist als die CI-gesteuerte Atmung, ermöglicht er eine relativ hohe ROS-Erzeugung18 für Signalzwecke28. Durch die Gewährung einer bevorzugten Verwendung von Fettsäuren deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Astrozyten der Erzeugung von mitochondrialen ROS, die für die Aufrechterhaltung der kognitiven Leistung unerlässlich sind, Vorrang vor einem bioenergetischen Nutzen einräumen (ergänzende Abbildung 5e). Es wird angenommen, dass Astrozyten ihren Energiebedarf größtenteils durch Glykolyse3,7,38,39,40,41 decken, einem Weg, der hier, wie wir zeigen, mit der Oxidation von Fettsäuren koexistiert. Angesichts unserer Daten ist der Beitrag dieser beiden Wege zur Bioenergetik und zu den Signalfunktionen jedoch nicht analog. Obwohl Fettsäuren über den TCA-Zyklus schneller oxidiert werden als Glukose in Astrozyten, zeigen Fettsäuren eine höhere Atmung, die mit der ATP-Produktion verbunden ist, was darauf hindeutet, dass für die Energiehomöostase mehr Brennstoff benötigt wird. Glykolyse und Fettsäureoxidation scheinen daher zwei Wege zu sein, die jeweils wesentliche Aspekte des Astrozytenstoffwechsels und der ROS-Signalisierung unterstützen.

Alle Protokolle wurden gemäß der Richtlinie 86/609/EWG der Europäischen Union und der Empfehlung 2007/526/EG zum Schutz von Tieren, die für Versuchs- und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, durchgeführt und in der spanischen Gesetzgebung durch das Gesetz 6/2013 umgesetzt. Die Protokolle wurden von der Bioethikkommission der Universität Salamanca oder CIC bioGUNE (Positronenemissionstomographie und Magnetresonanzspektroskopie) gemäß der spanischen Gesetzgebung (RD53/2013) genehmigt. Cpt1alox/lox-Mäuse wurden durch Einführung zweier loxP-Stellen, die ein Segment mit den Exons 11 und 12 des Cpt1a-Gens flankieren, durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen unter einem C57BL/6J-Hintergrund erzeugt19. Die Tiere wurden in der Tierversuchseinrichtung der Universität Salamanca in Käfigen (maximal fünf Tiere pro Käfig) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht ab 08:00 Uhr) gezüchtet. Die Luftfeuchtigkeit betrug 45–65 % und die Temperatur 20–25 °C. Die Tiere wurden nach Belieben mit fester Nahrung (20 % Proteine, 45 % Lipide und 35 % Kohlenhydrate sowie Mineralien und Vitamine) und Wasser gefüttert.

Dies wurde mithilfe einer validierten AAV-Strategie20 durchgeführt. Im Wesentlichen handelt es sich dabei um AAV-Partikel des PHP.eB-Kapsids (Serotyp), von denen bekannt ist, dass sie das Zentralnervensystem durch intravenöse Injektion42 effizient transduzieren und Cre-Rekombinase exprimieren, die durch den Astrozyten-spezifischen kurzen GFAP-Promotor (PHP.eB-AAV-gfaABC1D-Cre-GFP) gesteuert wird ) wurden intravenös (50 µl-Aliquots einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) mit 0,001 % Pluronic F-68, Sigma-Aldrich und 1 × 1011 Virusgenomen, VG) über den retroorbitalen Sinus an 2 Monate alte Kinder verabreicht Männliche Cpt1alox/lox-Mäuse unter einer kurzen Sevofluran-Anästhesie (Sevorane, bei 6 % zur Einleitung, gefolgt von etwa 3 % zur Aufrechterhaltung in Luft mit Zusätzen von O2 und NO2 0,4 bzw. 0,8 l/min, unter Verwendung einer Gasverteilungssäule, Hersill). H-3 und ein Verdampfer, InterMed Penlons Sigma Delta). Wir haben den retroorbitalen Sinus-intravenösen Weg gewählt, da die Erfolgsrate im Vergleich zum Schwanz- oder Schläfenweg höher war43. Geschwister von WT-Mäusen erhielten äquivalente Mengen derselben AAV-Partikel, die keine Cre-Rekombinase enthielten. Mäuse wurden ab 4 Wochen nach der AAV-Injektion verwendet.

Astrozyten in Primärkultur wurden aus der Kortikalis von 0–24 Stunden alten neugeborenen Cpt1alox/lox-Mäusen gewonnen28. Zellsuspensionen wurden in 175-cm2-Kunststoffflaschen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit niedrigem Glucosegehalt (5,5 mM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 4 mM Glutamin, ausgesät und bei 37 °C in einer angefeuchteten, 5 % CO2-haltigen Atmosphäre inkubiert . Um nicht-astrozytäre Zellen abzulösen, wurden die Kolben nach 7 Tagen in vitro (DIV) über Nacht bei 150 U/min geschüttelt. Der Überstand wurde verworfen und die anhaftenden, mit Astrozyten angereicherten Zellen wurden mit 0,8–1 × 105 Zellen pro cm2 in den entsprechenden Platten erneut ausgesät. Zellen wurden bei 9 DIV verwendet. Einzelne Primärkulturen kortikaler Mausneuronen wurden aus E14,5 Tage alten mCAT28- oder WT-Mäusen hergestellt und mit 2,0 × 105 Zellen pro cm2 in mit Poly-D-Lysin (10 μg ml−1) beschichtete Sechs-Well- oder Seahorse-Platten ausgesät. und in Neurobasal A, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 5,5 mM Glucose, 0,22 mM Pyruvat und 2 % Antioxidans B27, inkubiert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer angefeuchteten, 5 % CO2-haltigen Atmosphäre inkubiert. 72 Stunden nach dem Ausplattieren wurde das Medium durch 2 % des Minus-Antioxidans (d. h. ohne Vitamin E, Vitamin-E-Acetat, Superoxiddismutase, Katalase und Glutathion) B27-Ergänzung ersetzt. Neuronen wurden am 6. Tag verwendet. Um Astrozyten-Neuronen-Kokulturen zu erhalten, wurden Astrozyten bei 8 DIV auf semipermeablen Polyester-Transwell-Membraneinsätzen (4,5 cm2, 0,4 µm Porengröße; Corning) erneut ausgesät und 24 Stunden lang anhaften gelassen. Nach dieser Zeit wurden Astrozyten mit den adenoviralen Partikeln transduziert und nach 4 Tagen wurden Astrozyten enthaltende Inserts über 3 DIV-Neuronen platziert und in Neurobasal A, ergänzt mit 2 mM Glutamin, 5,5 mM Glucose, 0,22 mM Pyruvat und 2 % B27 minus, kokultiviert Antioxidanspräparat für 3 Tage. Immunzytochemie gegen neuronale (β-Tubulin III: 1/300; T2200; Sigma), Astrozyten (GFAP: 1/800; AB5541; Millipore), Oligodendrozyten (O4; 1/300; aus Maushybridomen, freundlicherweise gespendet von I. Fariñas). Labor) und Mikroglia-Marker (CD45; 1/200; 553076; BD) wurden durchgeführt, um die Reinheit der Kulturen zu bestimmen, die ungefähr 100 % Astrozyten (für mit Astrozyten angereicherte Kulturen) und 99,02 % Neuronen, 0,43 % Astrozyten, 0,11 % Oligodendrozyten, 0,13 % Mikroglia und 0,31 % andere Zellen (für mit Neuronen angereicherte Kulturen).

Dies wurde durch Transduktion von 9 DIV-Primärastrozyten, die aus Cpt1alox/lox-Mäusen gewonnen wurden, mit adenoviralen Partikeln durchgeführt, die Cre-Rekombinase enthalten, die durch den allgegenwärtigen Citomegalovirus (CMV)-Promotor (AdV-CMV-Cre-GFP) gesteuert wird. Als WT-Astrozyten wurden Astrozyten aus denselben Kulturen verwendet, die mit äquivalenten Mengen desselben AdV ohne Cre-Rekombinase (Ad V-CMV-GFP) transduziert wurden. Die Zellen wurden 5 Tage nach der Transduktion verwendet.

Für die Cpt1alox/lox-Genotypisierung wurde eine PCR mit den folgenden Primern durchgeführt: 5′-CAGCTGCTCCACACCAAGGCT-3′ (vorwärts) und 5′-TGCCCTTCTACTGTCACATGG-3′ (rückwärts), was zu einer Bande von 403 Basenpaaren (bp) für Cpt1lox/lox-Mäuse führte und 209 bp für WT19. Die PCR-Bedingungen waren 30 s bei 98 °C, 30 Zyklen von 5 s bei 98 °C, 5 s bei 60 °C, 10 s bei 72 °C und eine abschließende Verlängerung von 2 min bei 72 °C. Primer für die Genotypisierung des mCAT-Allels waren 5'-CTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCA-3', 5'-CGATTTGTGGTGTATGTAACTAATCTGTCTGG-3' und 5'-GCAGTGAGAAGAGTACCACCATGAGTCC-3', was eine 778-bp-Bande für das WT-Allel und eine 245-bp-Bande für das mCAT-Allel ergab mCAT-Allel. Die PCR-Bedingungen für die mCAT-Genotypisierung waren 5 Minuten bei 94 °C, 35 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 65 °C, 3 Minuten bei 68 °C und 8 Minuten bei 68 °C. PCR-Produkte wurden in 3 % Agarosegel unter Verwendung der 1-Kilobase-DNA-Leiter Plus (Thermo Fisher Scientific) aufgelöst.

Dies wurde an Gesamt-RNA-Proben durchgeführt, die aus Primärkulturen von Astrozyten und Neuronen mit dem GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt wurden. Die Amplifikationen wurden in 100 ng RNA unter Verwendung des Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step-Kits (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Primer waren (vorwärts bzw. rückwärts) 5'-GGATGGCTATGGTCAAGGTC-3' und 5'-GGCCTCACAGACTCCAGGTA-3' für Cpt1a; 5′-TGCTCCATGGCAACTGCTAT-3′ und 5′-ACTCCCAGAGGTGCCCAAT-3′ für Cpt1b; 5′-CGCCCAGTATGAGAGGATGT-3′ und 5′-CCCTACACGGAAGAATCTGC-3′ für Cpt1c; 5′-GCAGTGGTCTTCGAGTGGAT-3′ und 5′-CAGCTGCCTTCAGACCATCA-3′ für Acc1; 5′-GAGTGGAAGCGGTCTCACAG-3′ und 5′-GCAAGCCTTCGTCCACATCC-3′ für Acc2; 5′-TCATTGCCAAGGCGGTTGAT-3′ und 5′-GCCATGGACTCAGTCACATAC-3′ für Acadl; 5'-CATGCGAATCCTCCAGGAAG-3' und 5'-GCTACATCCACACCCACTTC-3' für Mtpα; 5′-GGGAATGGTGAAGACCGTGT-3′ und 5′-CCGTTCCCTTCGGATTCTCC-3′ für c-Fos; 5′-CACTCTCCCGTGAAGCCATT-3′ und 5-TCCTCCTCAGCGTCCACATA-3′ für Arc und 5′-AGAGTCATGAGCTGCCTGAC-3′ und 5′-CAACGTCACACTTCATGATG-3′ für β-Actin. Die mRNA-Häufigkeit jedes Transkripts wurde auf die von β-Actin normalisiert, das in derselben Probe erhalten wurde. Die resultierenden normalisierten Werte in Astrozyten wurden als Faltungsänderung gegenüber den entsprechenden normalisierten Werten in Neuronen ausgedrückt. Beim Vergleich von CPT1A KO mit WT-Astrozyten wurden die resultierenden normalisierten Werte für CPT1A KO als fache Änderung gegenüber den entsprechenden normalisierten Werten für WT-Astrozyten ausgedrückt.

Das erwachsene Maushirn (ohne Kleinhirn und Riechkolben) wurde mit dem Gehirndissoziationskit für erwachsene Mäuse (Miltenyi Biotec) dissoziiert. Das gereinigte Gewebe wurde mit einem sterilen Skalpell in 2 ml pro Hemisphäre einer Desintegrationslösung (Earle's Balanced Salt Solution, EBSS, 116 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,5 mM MgSO4, NaHCO3 26 mM, NaH2PO4·2H2O 1,01 mM) fragmentiert , Glucose 4 mM, Phenolrot 10 mg l-1, ergänzt mit Albumin 14,4 μl ml-1 und DNase Typ I 26 μl ml-1, pH 7,2, Trypsin 10,8 μl ml-1) und es wurde bei 37 °C trypsinisiert in einem thermostatisierten Bad für 5 Minuten unter häufigem Schütteln, um ein Dekantieren des Gewebes zu vermeiden. Es wurde durch fünfmaliges Verreiben mit einer serologischen 5-ml-Pipette mechanisch weiter zerkleinert. Anschließend wurde die Suspension 10 Minuten lang unter häufigem Schütteln wieder in das thermostatisierte Bad gegeben. Die Trypsinaktivität wurde durch Zugabe von 10 % fötalem Serum gestoppt, bevor das Gewebe 5 Minuten lang bei 700 g in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C zentrifugiert wurde. Nach dem Dekantieren des enzymatisch aufgeschlossenen Gewebes wurde das Pellet in einer trypsinfreien Desintegrationslösung (EBSS + 13 μl ml-1 DNase + 20 μl ml-1 Albumin) zur mechanischen Verreibung mit einer Pasteurpipette resuspendiert. Pro Volumen von 4 ml und pro Hemisphäre wurden etwa fünf Passagen durchgeführt. Der Überstand wurde 3 Minuten lang bei 700 g zentrifugiert und die Anzahl der Zellen im Pellet gezählt. Sobald eine homogene Suspension individualisierter adulter Nervenzellen erreicht war, wurden Zellpopulationstrennungen mithilfe der MACS-Technologie durchgeführt, wobei entweder das Astrozyten-spezifische Anti-ACSA-2-Microbead-Kit oder das neuronenspezifische Neuron Isolation Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (MACS-Technologie) verwendet wurde ). Wir bestätigten die Identität der isolierten Fraktionen durch Western Blot gegen astrozytische (GFAP), neuronale (MAP2) spezifische Marker und die Reinheit mit mikroglialen (Iba1) und oligodendroglialen (OLIG2) spezifischen Markern.

Für NDUFS1-Knockdown-Experimente verwendeten wir kleine interferierende RNAs (siRNAs) gegen NDUFS1 (siNDUFS1; s105592; Life Technologies) und eine siRNA-Kontrolle (siControl; 4390843; Life Technologies). Transfektionen mit siRNAs wurden mit dem Lipofectamine RNAiMAX-Reagenz (Life Technologies) gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung einer siRNA-Endkonzentration von 9 nM durchgeführt. Die Zellen wurden nach 3 Tagen verwendet.

Zur Beurteilung der oxidativen Flüsse von Fettsäuren, Glucose und Pyruvat verwendeten wir radiometrische Ansätze. Zu diesem Zweck wurden Astrozyten in 8-cm2-Kolben ausgesät, die an einem Mikrozentrifugenröhrchen hingen, das entweder 1 ml Benzethoniumhydroxid (Sigma) (zur 14CO2-Äquilibrierung) oder 1 ml H2O (zur 3H2O-Äquilibrierung) enthielt. Für Hirnschnitte wurden diese in 25-ml-Glaskolben gegeben, die eine zentrale Vertiefung mit einem Röhrchen enthielten, das 0,8 ml Benzethoniumhydroxid enthielt. Alle Inkubationen wurden in KRPG (NaCl 145 mM; Na2HPO4 5,7 mM; KCl 4,86 ​​mM; CaCl2 0,54 mM; MgSO4 1,22 mM; pH 7,35) mit 5 mM d-Glucose bei 37 °C in der luftthermostatisierten Kammer eines Orbitals durchgeführt Shaker. Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung für den oxidativen Stoffwechsel während der gesamten Inkubationszeit sicherzustellen, wurde die Atmosphäre der Kolben mit Carbogen (5 % CO2/95 % O2) begast, bevor sie mit Gummikappen verschlossen wurden. Um den Kohlenstofffluss von Fettsäuren zu CO2 zu messen, wurden Zellen (oder Hirnschnitte) in KRPG-Puffer (5 mM Glucose) mit 0,25 µCi ml−1 entweder [U-14C]- oder [1-14C]Palmitinsäure inkubiert ( plus 10 µM Palmitinsäure)44, wie in den Abbildungen angegeben. Um den Kohlenstofffluss von Glucose zu CO2 während des TCA-Zyklus zu messen, wurden Zellen in KRPG (5 mM D-Glucose) mit 0,25 μCi ml−1 D-[6-14C]Glucose45 inkubiert. Um den Kohlenstofffluss von Pyruvat zu CO2 durch mitochondriale Pyruvataufnahme und anschließende PDH-Aktivität zu messen, wurden die Zellen in KRPG (5 mM d-Glucose) mit 0,25 μCi ml-1 [1-14C]Pyruvat (plus 1 mM Pyruvat) inkubiert. Die Inkubationen wurden nach 90 Minuten durch Zugabe von 0,2 ml 20 %iger Perchlorsäure (Merck Millipore) beendet und nach weiteren 60 Minuten wurde das Röhrchen mit Benzethoniumhydroxid (mit dem eingeschlossenen 14CO2) verwendet, um die Radioaktivität mit einem Flüssigszintillationsanalysator zu bestimmen (Tri-Carb 4810 TR, PerkinElmer). Der glykolytische Fluss wurde gemessen, indem die Geschwindigkeit der 3H2O-Produktion aus [3-3H]Glucose unter Verwendung einer ähnlichen Strategie unter Verwendung von 3 μCi ml−1 d-[3-3H]Glucose in KRPG-Puffer (5 mM d-Glucose) für 120 gemessen wurde min (Ref. 45). Nachdem die Inkubationen mit 0,2 ml 20 %iger Perchlorsäure beendet wurden, wurden die Zellen weitere 96 Stunden lang inkubiert, um eine 3H2O-Äquilibrierung mit H2O im zentralen Mikrozentrifugenröhrchen zu ermöglichen. Das 3H2O wurde dann durch Flüssigkeitsszintillationszählung (Tri-Carb 4810 TR, PerkinElmer) gemessen. Für die Berechnungen wurde die spezifische Radioaktivität verwendet. Unter diesen Versuchsbedingungen wurden 75 % des produzierten 14CO2 und 28 % des produzierten 3H2O zurückgewonnen und für die Berechnungen berücksichtigt45. Um die Umwandlung von Fettsäuren in Ketone zu beurteilen, wurden Astrozyten in 8-cm2-Kolben mit KRPG (5 mM Glucose) beimpft. Die Geschwindigkeit der Ketonkörperbildung wurde durch Zugabe von 0,25 µCi ml-1 [1-14C]Palmitinsäure, gebunden an delipidiertes Rinderserumalbumin (BSA) (plus 10 µM Palmitinsäure), für 2 Stunden bestimmt. Danach wurden die Inkubationen mit 0,2 ml 20 %iger (v/v) Perchlorsäure beendet. Ketonkörper wurden als nichtflüchtiges, säurelösliches Produkt extrahiert10. Dazu wurde 1 ml des Mediums entnommen und in ein entfettetes 50-ml-Zentrifugenröhrchen (352070; FalconTM) gegeben, das 8 Vol. einer Chloroform:Methanol-Mischung (2:1, Vol./Vol.) und 2 Vol. KCl (0,1 Vol./Vol.) enthielt M). Nach dem Schütteln wurde es 5 Minuten lang bei 3.000 g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde entnommen und in ein anderes Röhrchen überführt, das 8 Vol. Chloroform:Methanol-Gemisch (2:1 Vol./Vol.) enthielt. Nach Schütteln und Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen wurde die obere wässrige Phase entnommen und zur Zählung in ein Flüssigszintillationsfläschchen überführt.

Die Laktatkonzentrationen im Kulturmedium wurden spektrophotometrisch45 durch Bestimmung der Absorptionszuwächse der Proben bei 340 nm in einer Mischung gemessen, die 1 mM NAD+, 8,25 U Laktatdehydrogenase in 0,25 M Glycin, 0,5 M Hydrazin und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure enthielt (EDTA)-Puffer, pH 9,5.

Astrozyten wurden 48 Stunden lang in frischem Medium inkubiert, das gesammelt und bei –80 °C eingefroren wurde. β-Hydroxybutyrat wurde mit einem spektrophotometrischen Nachweiskit (MAK134, Sigma) in 40 µl Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

OCRs von Zellen in Primärkultur oder frisch immunomagnetisch isolierten Zellen wurden in Echtzeit in einem XFe24 Extrazellulären Flussanalysator (Seahorse Bioscience; Seahorse Wave Desktop-Software v.2.6.1.56) gemessen. Dieses Gerät misst die Änderungen des O2-Flusses im extrazellulären Medium von Zellen, die in XFe24-Well-Platten ausgesät sind. Das reguläre Zellmedium wurde entfernt und zweimal mit DMEM-Laufmedium (XF-Assay modifiziert, ergänzt mit 5 mM Glucose, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 5 mM HEPES, pH 7,4) gewaschen und 30 Minuten lang bei 37 °C ohne CO2 inkubiert min, damit sich die Zellen mit dem Testmedium vorab äquilibrieren können. Oligomycin, FCCP (Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon) und eine Mischung aus Rotenon und Antimycin, verdünnt in DMEM-Laufmedium, wurden jeweils in Port-A, Port-B und Port-C geladen. Die Endkonzentrationen in XFe24-Zellkultur-Mikrotiterplatten betrugen 1 μM Oligomycin, 2 μM FCCP, 1 μM Rotenon und 2,5 μM Antimycin. Sofern nicht anders beschrieben, war die Reihenfolge der Messungen wie folgt. Der Grundwert der OCR wurde dreimal gemessen, und dann wurde Port-A injiziert und 3 Minuten lang gemischt, nachdem die OCR dreimal 3 Minuten lang gemessen wurde. Gleiches Protokoll mit Port-B und Port-C. Die OCR wurde nach jeder Injektion gemessen, um den mitochondrialen oder nicht-mitochondrialen Beitrag zur OCR zu bestimmen. Alle Messungen wurden normalisiert, um drei Messungen des Grundniveaus (Ausgangsniveaus) der zellulären OCR jeder Vertiefung zu mitteln, wobei die nicht-mitochondriale OCR abgezogen wurde. Jede Probe wurde in 3–5 Replikaten gemessen. Die Experimente wurden drei- bis fünfmal in biologisch unabhängigen Kulturpräparaten wiederholt. Die nicht-mitochondriale OCR wurde durch OCR nach Injektion von Antimycin plus Rotenon zusammen oder getrennt bestimmt. Die maximale Atmung wurde durch die maximale OCR-Rate nach FCCP-Injektion minus nicht-mitochondrialer OCR bestimmt. Die ATP-Produktion wurde durch die letzte OCR-Messung vor der Oligomycin-Injektion abzüglich der minimalen OCR-Messung nach der Oligomycin-Injektion bestimmt. Wenn angezeigt, wurde Etomoxir (100 μM) in Port-A injiziert, um die fettsäureabhängige Atmung zu bestimmen, die durch Subtraktion des minimalen OCR-Werts nach Etomoxir von dem vor der Etomoxir-Injektion erhalten wurde. Um die CI-unterstützte mitochondriale Atmung abzuschätzen, wurde die OCR vor der Rotenon-Injektion von der minimalen OCR-Messung nach der Rotenon-Injektion abgezogen, und von diesem Wert wurde dann die nicht-mitochondriale OCR abgezogen. Wir haben auch die CI-unterstützte Atmung in permeabilisierten Zellen bestimmt. Zu diesem Zweck wurde der XF-DMEM-Puffer auf Mannitol- und Saccharose-Puffer (enthaltend 70 mM Saccharose, 220 mM Mannitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES und 1 mM EGTA, pH 7,2) umgestellt und der basale OCR-Wert überwacht. Um die OCR in permeabilisierten Zellen zu beurteilen, wurden Digitonin (25 µg ml-1), L-Glutamin:Malat (Gln:Mal; 4 mM:0,5 mM) und ADP (1 mM) hinzugefügt, um die NAD+-Reduktion und Atmung zu stimulieren. Rotenon und Antimycin wurden nacheinander hinzugefügt, um die CI-unterstützte Atmung und die nicht-mitochondriale OCR unabhängig voneinander zu berechnen. Die CI-Daueratmung wurde als Differenz zwischen der OCR nach Digitonin/Gln/Mal/ADP und der OCR nach Antimycin (nicht-mitochondriale OCR) berechnet.

Die Zellen wurden gesammelt und in 10 mM Phosphatpuffer (KH2PO4; pH 7,0) suspendiert. Nach drei Zyklen des Einfrierens und Auftauens, um den Zellaufschluss sicherzustellen, wurden die spezifischen Aktivitäten von CI, CI–III, CII–III, CIV und Citrat-Synthase bestimmt. Die Aktivität von Rotenon-sensitivem CI (NADH-Ubichinonoxidoreduktase)46 wurde in KH2PO4 (25 mM, pH 7,2) in Gegenwart von 10 mM MgCl2, 2,5 mg ml−1 BSA, 0,15 mM NADH und 1 mM KCN ​​gemessen. Änderungen der Absorption bei 340 nm (30 °C) (ε = 6,81 mM−1 cm−1) wurden nach Zugabe von 50 µM Ubichinon und 10 µM Rotenon aufgezeichnet. Die Aktivität von CI–III (NADH-Cytochrom-C-Oxidoreduktase) wurde in KH2PO4 (25 mM; pH 7,2) in Gegenwart von 10 mM MgCl2, 50 mg ml−1 BSA, 300 mM KCN ​​und 330 mM oxidiertem Cytochrom c bestimmt. Änderungen der Absorption wurden nach Zugabe von 10 mM NADH und 10 µM Antimycin A plus 25 µM Rotenon aufgezeichnet (550 nm; 30 °C) (ε = 19,2 mM−1 cm−1). Die Aktivität von CII–III (Succinat-Cytochrom-C-Oxidoreduktase)47 wurde in Gegenwart von 100 mM Phosphatpuffer plus 0,6 mM EDTA(K+), 2 mM KCN ​​und 200 µM Cytochrom c bestimmt. Änderungen der Absorption wurden nach der Zugabe von 20 mM Succinat und 10 µM Antimycin A aufgezeichnet (550 nm; 30 °C) (ε = 19,2 mM−1 cm−1). Für die CIV-Aktivität (Cytochrom-C-Oxidase) war die erstklassig konstant, k (min−1 mg Protein−1) der Cytochrom-c-Oxidation wurde in Gegenwart von 10 mM Phosphatpuffer (KH2PO4; pH 7,0) und 50 µM reduziertem Cytochrom c bestimmt48; Die Absorption wurde jede Minute bei 550 nm und 30 °C aufgezeichnet (ε = 19,2 mM−1 cm−1). Die Citrat-Synthase-Aktivität49 wurde in Gegenwart von 93 mM Tris-HCl, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 0,2 mM Acetyl-CoA und 0,2 mM 5,5-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure) gemessen. (DTNB); Die Reaktion wurde mit 0,2 mM Oxalacetat gestartet und die Absorption wurde bei 412 nm (30 °C) aufgezeichnet (ε = 13,6 mM−1 cm−1). Die Daten wurden als Verhältnis der Aktivitäten jedes Komplexes zur Citrat-Synthase-Aktivität ausgedrückt.

Die PDH-Aktivität wurde durch die Reduktion von NAD+ zu NADH bestimmt, gekoppelt mit der Reduktion eines Reporterfarbstoffs, um ein farbiges Reaktionsprodukt mit einer Zunahme der Absorption bei 450 nm bei Raumtemperatur zu ergeben, unter Verwendung des PDH Enzyme Activity Microplate Assay Kit (Abcam, Katalog). Nr. ab109902) gemäß den Anweisungen des Herstellers. In jede Vertiefung wurden Zellhomogenate (300 μg Protein) gegeben und das solubilisierte PDH-Enzym 3 Stunden lang immuneingefangen. Nach zweimaligem Waschen mit Stabilisator wurde frische Testlösung zugegeben und die Absorption jeder Vertiefung bei 37 °C mit einem kinetischen Programm bei 450 nm für 30 Minuten und einem Ableseintervall von 60 Sekunden in einem Varioskan Flash (Thermo Scientific) gemessen. Die PDH-Aktivität (μOD × min−1) wurde als anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit ausgedrückt, die aus den Steigungen der erzeugten Kurven bestimmt wurde.

Die Zellen wurden mit 1 % (w/v) Sulfosalicylsäure lysiert, 5 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 g zentrifugiert und die Überstände wurden zur Bestimmung des Gesamtglutathions (d. h. reduziertes Glutathion plus doppelte Konzentration an oxidiertem Glutathion) verwendet Glutathion), unter Verwendung von oxidiertem Glutathion (0–50 µM) als Standard, wie zuvor beschrieben50. Gesamtglutathion wurde in Reaktionspuffer (0,1 mM NaHPO4, 1 mM EDTA, 0,3 mM DTNB, 0,4 mM NADPH, Glutathionreduktase 1 U ml−1, pH 7,5) gemessen, indem der Anstieg der Absorption nach der Reaktion von reduziertem Glutathion mit DTNB aufgezeichnet wurde für 2,5 min in 15 s-Intervallen mit einem Varioskan Flash (Thermo Fisher) Spektrophotometer (λ = 405 nm). Die Glutathionkonzentration (nmol mg-1 Protein) wurde aus den in den Proben erhaltenen Steigungen berechnet und auf die im Standard erhaltenen Steigungen extrapoliert.

Um die durch adenovirale Partikel vermittelte Cre-Rekombinase-Transduktionseffizienz in primären Astrozytenkulturen zu bewerten, wurden die Zellen fixiert, mit dem Fix & Perm-Kit (Becton Dickinson Biosciences) permeabilisiert und mit Anti-CPT1A-Antikörper (1/500) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit dem sekundären Cy5-konjugierten Antikörper 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und im FACScalibur-Durchflusszytometer (15 mW Argonionenlaser; CellQuest-Software, Becton Dickinson Biosciences) unter Verwendung der FL1- und FL4-Kanäle für die GFP- und CPT1A-Markierung analysiert. jeweils.

Die Zellen wurden vorsichtig mit 1 mM EDTA (Tetranatriumsalz) in PBS (pH 7,4) von den Platten gelöst. APC-konjugiertes Annexin-V und 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) (Becton Dickinson Biosciences) wurden verwendet, um den Prozentsatz apoptotischer Neuronen mittels Durchflusszytometrie quantitativ zu bestimmen. Die Zellen wurden mit Annexin-V-APC und 7-AAD in Bindungspuffer (100 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt und 5 × 104 Zellen wurden in drei Wiederholungen pro Bedingung analysiert. auf einem FACScalibur-Durchflusszytometer (15 mW Argonionenlaser; CellQuest-Software, Becton Dickinson Biosciences) unter Verwendung von FL4- bzw. FL3-Kanälen. Annexin+- und 7-AAD−-Zellen galten als apoptotisch. Der Analysatorschwellenwert wurde auf dem Durchflusszytometerkanal angepasst, um die meisten subzellulären Trümmer auszuschließen und das Hintergrundrauschen aufgrund der Neuritenstörung während der neuronalen Ablösung zu reduzieren. Die Daten wurden als Prozentsätze ausgedrückt.

Eine Hemisphäre von 12 Monate alten WT- oder Astrozyten-spezifischen CPT1A-KO-Mäusen (n = 6 für jede Bedingung) wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für die ungezielte Metabolomics-Analyse (Metabolon Incorporated) verwendet. Bei der Analyse mit Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie wurden 751 Metaboliten nachgewiesen. Rohdaten wurden vom Metabolon-Dienst extrahiert, Peaks identifiziert, zur Qualitätskontrolle verarbeitet, kuratiert, normalisiert und log2-transformiert. Die Peaks wurden anhand der Fläche unter der Kurve quantifiziert. Bei Studien, die sich über mehrere Tage erstreckten, wurde ein Datennormalisierungsschritt durchgeführt, um Abweichungen zu korrigieren, die sich aus Abstimmungsunterschieden der Instrumente zwischen den Tagen ergeben. Im Wesentlichen wurde jede Verbindung in Lauftagesblöcken korrigiert, indem die Mediane auf eins (1,00) registriert und jeder Datenpunkt proportional normalisiert wurde. Nach der Imputation fehlender Werte mit dem minimal beobachteten Wert für jede Verbindung wurden Welchs T-Tests mit zwei Stichproben verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die sich zwischen den Versuchsgruppen signifikant unterscheiden. Mithilfe dieser Filter haben wir eine hohe Schätzung der Falscherkennungsrate (q-Wert ≤ 0,50) akzeptiert, obwohl andere Überlegungen durchgeführt wurden, um festzustellen, ob ein Ergebnis einer weiteren Prüfung bedarf. Zu diesen Beweisen gehörten (1) biologische Relevanz angesichts des genetischen Hintergrundkontexts; (2) Einbeziehung in einen gemeinsamen Weg mit einer hochsignifikanten Verbindung; (3) Zugehörigkeit zu einer ähnlichen funktionellen biochemischen Familie mit anderen wichtigen Verbindungen oder (4) Korrelation mit anderen experimentellen Ansätzen. Grafiken entsprechend der statistischen Analyse wurden mit GraphPad v.8.0 und dem Online-Tool MetaboAnalyst v.5.0 erstellt.

Proteinproben wurden mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo) unter Verwendung von BSA als Standard quantifiziert.

Die Zellen wurden in RIPA-Puffer (1 % Natriumdodecylsulfat, 10 mM EDTA, 1 % (Vol./Vol.) Triton μM Phenylmethylsulfonylfluorid und Phosphataseinhibitoren (1 mM O-Vanadat). Die Proben wurden 5 Minuten lang gekocht. Aliquots von Zelllysaten (40 μg Protein) wurden einer SDS-PAGE auf einem 8 bis 12 % (Vol./Vol.) Acrylamidgel (MiniProtean; Bio-Rad) einschließlich PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo) unterzogen. Die aufgelösten Proteine ​​wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulosemembranen (0,2 µm, Bio-Rad) übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % (Gew./Vol.) fettarmer Milch in TTBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl und 0,1 % (Vol/Vol) Tween 20, pH 7,5) 1 Stunde lang blockiert. Nach der Blockierung wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern immungeblottet. Nach Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP (1/10.000, Santa Cruz Biotechnologies), Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP (1/10.000, Bio-Rad), Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG-HRP (1/10.000, Abcam) oder Ziege Antikaninchen-IgG-HRP (1/3.000, Bio-Rad) wurden Membranen sofort mit dem verstärkten Chemilumineszenz-Kit WesternBright ECL (Advansta) oder Supersignal West Femto (Thermo) inkubiert, bevor sie einem Fuji Medical X-Ray-Film (Fujifilm) ausgesetzt oder verwendet wurden der Fusion FX Transilluminator (Vilber GmbH). Die Proteinhäufigkeiten aller Western Blots pro Bedingung wurden durch Densitometrie der Banden in der linearen Phase der Belichtung ohne Erreichen der Sättigung auf den Filmen oder auf den gescannten Autoradiogrammen mit der Software ImageJ v.1.48 gemessen. Es wurden immer mindestens drei biologisch unabhängige Replikate durchgeführt, obwohl in den Hauptabbildungen normalerweise nur ein repräsentativer Western Blot dargestellt ist.

Das Immunblotting wurde mit Anti-CPT1A (1/1.000) (ab128568; Abcam), Anti-CPT1B (1/1.000) (ab134988; Abcam), Anti-CPT1C (1/1.000) (ab87498; Abcam) und Anti-CTP2 ( 1/1.000) (ab181114; Abcam), Anti-Hitzeschock-Protein-60 (HSP60) (1/1.000) (ab46798; Abcam), Anti-TOMM20 (1/1.000) (ab56783; Abcam), Anti-NDUFS1 ( 1/500) (sc-50132; Santa Cruz Biotechnology), Anti-UQCRC2 (1/1.000) (ab14745; Abcam), Anti-GFAP (1/500) (G6171; Sigma), Anti-NDUFB8 (1/1.000) (ab110242; Abcam), Anti-NDUFA9 (1/1.000) (ab14713; Abcam), Anti-SDHA (1/1.000) (ab14715; Abcam), Anti-MTCO1 (1/1.000) (ab14705; Abcam), Anti- COX IV (1/1.000) (ab16056; Abcam), Anti-Iba1 (1/1.000) (019-19741; Wako), Anti-MAP2 (1/1.000) (ab32454; Abcam), Anti-OLIG2 (1/1.000). ) (ab109186; Abcam), Anti-PDHA1 (1/1.000) (Nr. 3205; Cell Signaling), Anti-phosphoSer293-PDHA1 (1/1.000) (Nr. 31866; Cell Signalling), Anti-β-Tubulin III ( 1/300) (T2200; Sigma) und Anti-β-Actin (1/30.000) (A5441; Sigma).

Um die mitochondriale Fraktion zu erhalten, wurden Zellpellets bei –80 °C eingefroren und in einem Glas-Teflon-Potter-Elvehjem-Homogenisator in Puffer A (83 mM Saccharose und 10 mM MOPS; pH 7,2) homogenisiert (10–12 Hübe). Das gleiche Volumen an Puffer B (250 mM Saccharose und 30 mM MOPS) wurde zur Probe gegeben und das Homogenat wurde zentrifugiert (1.000 g, 5 Minuten), um intakte Zellen und Kerne zu entfernen. Anschließend wurde der Überstand zentrifugiert (12.000 g, 3 Minuten), um die mitochondriale Fraktion zu erhalten, die in Puffer C (320 mM Saccharose; 1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl; pH 7,4) gewaschen wurde18. Mitochondrien wurden in Puffer D (1 M 6-Aminohexansäure und 50 mM Bis-Tris-HCl, pH 7,0) suspendiert.

Zur Beurteilung der Komplex-I-Organisation wurden mit Digitonin gelöste (4 g g−1) Mitochondrien (10–50 μg) in NativePAGE Novex 3–12 % (Vol./Vol.) Gele (Life Technologies) geladen. Nach der Elektrophorese wurde die NADH-Dehydrogenase-Aktivität im Gel bewertet, was die Identifizierung einzelner Komplex I- und Komplex I-haltiger SC-Banden aufgrund der Bildung violetter Ausfällungen an der Stelle von Komplex I ermöglichte (Lit. 18). Kurz gesagt, die Gele wurden in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), 1 mg ml−1 Nitroblautetrazolium und 0,14 mM NADH inkubiert. Als nächstes wurde ein direkter Elektrotransfer durchgeführt, gefolgt von einem Immunoblot gegen den mitochondrialen Komplex-I-Antikörper NDUFS1 und den Komplex-III-Antikörper UQCRC2. Der direkte Transfer von BNGE erfolgte nach 20-minütigem Einweichen der Gele (4 °C) in Carbonatpuffer (10 mM NaHCO3; 3 mM Na2CO3·10H2O; pH 9,5–10). Der Proteintransfer auf Polyvinylidenfluoridmembranen wurde 90 Minuten lang bei 60 V und 4 °C in Carbonatpuffer durchgeführt.

Mitochondriale ROS wurden mit der Fluoreszenzsonde MitoSox (Life Technologies) bestimmt. Kultivierte Zellen oder Suspensionen erwachsener Gehirnzellen wurden mit 2 μM MitoSox 30 Minuten lang bei 37 °C in einer 5 % CO2-Atmosphäre in gepufferter Hank-Kochsalzlösung (134,2 mM NaCl, 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HPO4·2H2O, 5,44 mM Glucose, 20 mM HEPES und 20 mM CaCl2·2H2O, pH 7,4). Die Zellen wurden dann mit PBS (136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4; pH 7,4) gewaschen und durch Trypsinisierung gesammelt. Die Intensität der MitoSox-Fluoreszenz wurde mittels Durchflusszytometrie (FACScalibur-Durchflusszytometer, BD Biosciences) bewertet und in willkürlichen Einheiten ausgedrückt.

Für H2O2-Bewertungen wurde AmplexRed (Life Technologies) verwendet. Die Zellen wurden trypsinisiert und in KRPG-Puffer (145 mM NaCl, 5,7 mM Na2HPO4, 4,86 ​​mM KCl, 0,54 mM CaCl2, 1,22 mM MgSO4, 5,5 mM Glucose, pH 7,35) in Gegenwart von 9,45 μM AmplexRed mit 0,1 U ml-1 Meerrettich inkubiert Peroxidase. Die Lumineszenz wurde 2 Stunden lang in 30-Minuten-Intervallen mit einem Varioskan Flash (Thermo Scientific) aufgezeichnet (Anregung 538 nm; Emission 604 nm). Zur Berechnung der Geschwindigkeiten der H2O2-Bildung wurden Steigungen verwendet.

Das mitochondriale Membranpotential (Δψm) wurde mit MitoProbe DilC1(5) (Life Technologies) (50 nM) mittels Durchflusszytometrie (FACScalibur-Durchflusszytometer, BD Biosciences) bewertet und in willkürlichen Einheiten ausgedrückt. Zu diesem Zweck wurden Zellsuspensionen mit der Sonde 30 Minuten bei 37 °C in PBS inkubiert. Δψm werden nach Abzug des Potentialwerts erhalten, der in Gegenwart von Carbonylcyanid-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (CCCP) (10 µM, 15 Min.) für jede Probe bestimmt wurde.

Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Xylazinhydrochlorid (Rompun; Bayer) und Ketaminhydrochlorid:Chlorbutol (Imalgene; Merial) (1:4, v/v) in einer Menge von 1 ml pro kg Körpergewicht anästhesiert und dann intraaortal mit perfundiert 0,9 % NaCl zur Entfernung von Blutzellen. Nach der Perfusion wurden die Gehirne sagital in zwei Teile herauspräpariert und mit Somogyi (4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd und 10 % (Vol./Vol.) Methanol in 0,1 M Phosphatpufferlösung; pH 7,4) 96 Stunden lang bei 4 °C nachfixiert C. Hirnblöcke wurden dreimal mit 0,1 M Phosphatpufferlösung gespült und nacheinander in 10, 20 und 30 % (Gew./Vol.) Saccharose in Phosphatpufferlösung kryogeschützt, bis sie absanken. Nach Eintauchen in ein Medium mit optimaler Schnitttemperatur und Einfrieren für mindestens 24 Stunden wurden 30 μm dicke Sagittalschnitte mit einem Gefrier-Schiebe-Kryostat (Leica) erhalten. Für die Immunhistochemie wurden die Schnitte nacheinander in (1) 5 mg ml-1 Natriumborhydrid in Phosphatpufferlösung für 30 Minuten inkubiert (um Aldehyd-Autofluoreszenz zu entfernen); (2) drei PBS-Waschvorgänge von jeweils 10 Minuten; (3) 1/5.000 Anti-GFP (ab290; Abcam) in 0,02 % Triton X-100 (Sigma) und 5 % Ziegenserum (Jackson Immuno-Research) in 0,1 M Phosphatpufferlösung für 72 Stunden bei 4 °C; (4) drei Waschvorgänge mit Phosphatpufferlösung von jeweils 10 Minuten Dauer; (5) Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper 1/500 Cy2 Ziegen-Antikaninchen (Jackson Immuno-Research) in Phosphatpufferlösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur und (6) 0,5 μg ml−1 4,6-Diamidino-2-phenylindol in Phosphatpuffer Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Spülen mit Phosphatpufferlösung wurden die Schnitte mit dem wässrigen Eindeckmedium Fluoromount (Sigma) und Deckgläsern (Thermo Fisher) montiert. Die Schnitte wurden mit Epifluoreszenz und den entsprechenden Filtersätzen unter einem Operetta CLS High-Content-Bildgebungssystem (PerkinElmer) untersucht. Hochauflösende Bilder wurden mit einem OperaPHX/OPRTCLS Air Objective ×20 hNA-Objektiv aufgenommen.

Mäuse (1–9 Monate nach der AAV-Injektion, also 3–12 Monate alt) wurden mindestens 15 Minuten lang im gleichen Zeitfenster des Tages (14:00 bis 20:00 Uhr) im Raum akklimatisiert. Die Verfolgung wurde jeweils einmal durchgeführt und das Gerät zwischen den Versuchen sorgfältig mit 70 %igem Ethanol gereinigt, um etwaige Geruchsspuren zu entfernen. Es wurde ein ANY-Box-Kern verwendet, der eine hellgraue Basis und einen verstellbaren senkrechten Stab mit einer Kamera und einem Infrarot-Fotostrahlarray enthielt, um die Bewegung des Tieres bzw. das Aufzuchtverhalten zu erkennen. Mausbewegungen wurden mit der ANY-maze-Software und der AMi-maze-Schnittstelle verfolgt, um alle nachfolgend beschriebenen Parameter zu registrieren. Für den Freifeldtest wurde ein 40 × 40 × 35 cm (Breite, Tiefe, Höhe) schwarzer, infrarottransparenter Plexiglaseinsatz verwendet und die Arena in drei Zonen unterteilt, nämlich den Rand (8 cm breit), die Mitte (16 %). der gesamten Arena) und Zwischenzonen (die verbleibende Fläche). Der Test dauerte 10 Minuten und es wurden die zurückgelegte Distanz, die Anzahl der Aufzuchten und die in jeder Zone verbrachte Zeit gemessen. Zur Analyse des motorischen Gleichgewichts und der Koordination wurde ein Rotarod-Test (Rotarod-Gerät, Modell 47600, Ugo Basile) verwendet. Die Mäuse wurden zuvor an drei aufeinanderfolgenden Tagen, zwei Tage vor dem Test, trainiert. Die Rotarod-Bedingungen waren eine allmähliche Beschleunigung von 4 auf 25 U/min, wobei die Endgeschwindigkeit nach 270 s erreicht wurde. Um das Kurzzeitgedächtnis zu analysieren, verwendeten wir den neuartigen Objekterkennungstest (Stoelting) in einem 40 × 40 × 35 cm (Breite, Tiefe, Höhe) großen Kern mit schwarzem infrarottransparentem Plexiglas-Einsatz, der ebenfalls mit der ANY-maze-Software verfolgt wurde die AMi-maze-Schnittstelle zur Registrierung der Spur der Mäuse. Die Mäuse wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen jeweils 10 Minuten lang an diese Umgebung gewöhnt, und der Test wurde am dritten Tag durchgeführt. Den Mäusen wurde die Erkundung zweier identischer, äquidistanter Würfel 5 Minuten lang überlassen (Gewöhnungsphase) und sie kehrten für 30 Minuten in ihren Käfig zurück. Ein Würfel wurde durch eine Kugel ähnlicher Größe und Farbe ersetzt und die Mäuse wurden in die Arena zurückgebracht, um die Objekte weitere 5 Minuten lang zu erkunden (die Testphase). Um Zoneneinträge zu bewerten, die die Erkundung eines Objekts berücksichtigen, berücksichtigen wir die Größe des Objekts (3,8 × 3,8 cm) und den umgebenden Umfang (6 × 6 cm). Die Fähigkeit, die Kugel als neuartiges Objekt zu erkennen, wurde als Diskriminierungsindex (DI) bestimmt, der wie folgt berechnet wurde: DI = (TN − TF)/(TN + TF), wobei TN die Zeit ist, die für die Erkundung des neuen Objekts (der Kugel) aufgewendet wurde ) und TF ist die Zeit, die für die Erkundung des vertrauten Objekts (Würfels) aufgewendet wird. Für den Barnes-Labyrinthtest verwendeten wir eine Ausrüstung, die aus einer grauen kreisförmigen Plattform (120 cm Durchmesser, 90 cm über dem Boden) bestand. Entlang seines Umfangs befanden sich 20 gleichmäßig verteilte Löcher. Das Labyrinth verfügt über eine herausnehmbare Fluchtbox, die unter jedem der Löcher angebracht werden konnte und vor jedem Experiment mit Tiereinstreu gefüllt wurde. Als räumliche visuelle Hinweise wurden schwarz-weiß gemusterte Bilder verwendet. Alle Sitzungen wurden bei einer Raumbeleuchtung von 400 Lux durchgeführt, um die Abneigung der Mäuse gegenüber der Plattform zu erhöhen. Der Test bestand aus drei Phasen. Die erste Phase ist die Gewöhnungsphase, in der die Tiere einen Tag vor den Trainingseinheiten 5 Minuten lang die Plattform frei erkunden konnten. Anschließend durchliefen die Tiere die Trainingsphase, in der sie das Spillloch für maximal 5 Minuten über 3 Tage mit vier Sitzungen pro Tag lokalisieren durften. Schließlich wurden die Mäuse für die Sondenphase auf ihr räumliches Gedächtnis getestet. In dieser Sitzung wurde der Fluchtkasten entfernt und die Plattform praktisch in vier Quadranten mit jeweils fünf Löchern unterteilt. Den Mäusen wurde erlaubt, das Labyrinth fünf Minuten lang zu erkunden, und die Zeit, die sie in dem Quadranten verbrachten, der zuvor die Fluchtbox enthielt, wurde quantifiziert. Die Anzahl der ausgewerteten Tiere pro Versuch ist in den Legenden der Abbildungen angegeben (8 ≥ n ≤ 13).

Für einfache Vergleiche verwendeten wir einen ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test und schließlich einen mehrfachen ungepaarten Student-t-Test, mit Ausnahme von (1) Abb. 2e–h und (2) Abb. 3h,l, in denen wir verwendet haben gepaarter Student-t-Test (zweiseitig), da (1) jedes Primärkulturpräparat und jedes Experiment an einem anderen Tag durchgeführt wurde und (2) in diesen Experimenten Neuronen aus demselben Präparat gewonnen und dann zwei Arten von ausgesetzt wurden einfügen (diejenigen, die WT enthalten, und diejenigen, die CPT1A-KO-Astrozyten enthalten). Für andere Vergleiche mit mehreren Werten verwendeten wir eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukey-Tests. Alle verwendeten Tests sind in jeder Abbildungslegende angegeben. Die statistische Analyse haben wir mit der Software GraphPad Prism v.8 durchgeführt. Die Anzahl der pro Versuch verwendeten biologisch unabhängigen Kulturpräparate bzw. Tiere ist in den Legenden der Abbildungen angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

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Referenzen herunterladen

Wir danken M. Resch, M. Carabias-Carrasco, L. Martin und E. Prieto-Garcia für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung, State Research Agency (Zuschussnummern PID2019-105699RB-I00/AEI/10.13039/501100011033 und RED2018-102576-T an JPB und SAF2017-90794-REDT an AA), Institute of Charles, finanziert III Health (Zuschuss-Nr. CB16/10/00282 an JPB und PI18/00285 und RD16/0019/0018 an AA), Board of Castile and Leon (Zuschuss-Nr. CS/151P20) und Ladder of Excellence (Zuschuss-Nr. CLU) . -2017-03 an JPB und AA).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Brenda Morant-Ferrando, Daniel Jimenez-Blasco.

Institut für funktionelle Biologie und Genomik (IBFG), Universität Salamanca, CSIC, Salamanca, Spanien

Brenda Morant-Ferrando, Daniel Jimenez-Blasco, Paula Alonso-Batan, Jesús Agulla, Rebeca Lapresa, Dario Garcia-Rodriguez, Sara Yunta-Sanchez, Irene Lopez-Fabuel, Emilio Fernandez, Angeles Almeida, Marina Garcia-Macia und Juan P. Bolaños

Institut für biomedizinische Forschung von Salamanca (IBSAL), Universitätsklinikum Salamanca, Salamanca, Spanien

Brenda Morant-Ferrando, Daniel Jimenez-Blasco, Paula Alonso-Batan, Jesús Agulla, Rebeca Lapresa, Dario Garcia-Rodriguez, Sara Yunta-Sanchez, Irene Lopez-Fabuel, Emilio Fernandez, Angeles Almeida, Marina Garcia-Macia und Juan P. Bolaños

Netzwerk des Zentrums für biomedizinische Untersuchungen zu Gebrechlichkeit und Altern (CIBERFES), Madrid, Spanien

Daniel Jimenez-Blasco, Emilio Fernandez, Marina Garcia-Macia und Juan P. Bolaños

Labor für Angiogenese und Gefäßstoffwechsel, Vesalius-Forschungszentrum, Leuven, Belgien

Peter Carmeliet

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JPB hatte die Idee. JPB, MG-M. und AA hat die Forschung entworfen. BM-F., MG-M., DJ-B., PA-B., JA, DG-R., SY-S., RL, IL-F. und EF führte Untersuchungen durch. JPB, MG-M., BM-F., DJ-B., AA, JA, DG-R., RL, IL-F. und EF analysierte Daten. PC hat Materialien beigesteuert. JPB hat das Manuskript geschrieben. Alle Co-Autoren haben das Manuskript bearbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Angeles Almeida, Marina Garcia-Macia oder Juan P. Bolaños.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Metabolism dankt Manuel Guzman und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur für Handhabung: Alfredo Giménez-Cassina, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Ergänzende Abbildungen. 1–5.

Diese Datei enthält die Quelldaten der Ergänzenden Abbildungen.

Diese Datei enthält eine Tabelle mit Namen, Quelle, Katalognummer und Referenzen der verwendeten Antikörper.

Diese Datei enthält die unverarbeiteten und unbeschnittenen Western Blots, die in den Zusatzinformationen der Arbeit aufgeführt sind.

Diese Datei enthält repräsentative Diagramme der Durchflusszytometrieanalysen der Proben in der Arbeit.

Diese Datei enthält die Tabellen mit den statistischen Analysen der ergänzenden Abbildungen der Arbeit.

Diese Datei enthält die Quelldaten der Hauptfiguren.

Diese Datei enthält die unverarbeiteten und unbeschnittenen Western Blots, die in den Hauptabbildungen der Arbeit gezeigt werden.

Diese Datei enthält die Tabellen mit den statistischen Analysen der Hauptfiguren der Arbeit.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Morant-Ferrando, B., Jimenez-Blasco, D., Alonso-Batan, P. et al. Die Oxidation von Fettsäuren organisiert mitochondriale Superkomplexe, um astrozytäre ROS und Kognition aufrechtzuerhalten. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00835-6

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Eingegangen: 29. November 2022

Angenommen: 02. Juni 2023

Veröffentlicht: 17. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00835-6

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Naturstoffwechsel (2023)