Ein injizierbares Copolymer aus Fettsäuren (ARA 3000 BETA) als vielversprechende Behandlung von Arthrose

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7783 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Arthrose (OA) ist die häufigste rheumatische Erkrankung und eine schnell wachsende Ursache für Behinderungen. Aktuelle pharmakologische Behandlungen umfassen Analgika und nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente zur Schmerz- und Entzündungskontrolle sowie langsam wirkende Medikamente wie die intraartikuläre (IA) Verabreichung von Hyaluronsäure. Eine orale Nahrungsergänzung oder eine Ernährung, die reich an mehrfach ungesättigten freien Fettsäuren ist, werden vorgeschlagen, doch die Belege für einen Nutzen werden noch diskutiert. Wir haben hier das therapeutische Potenzial von ARA 3000 BETA, einem injizierbaren Copolymer aus Fettsäuren, auf struktureller Ebene bei Arthrose untersucht. Das Kollagenase-induzierte Osteoarthritis-Modell wurde bei C57BL/6-Mäusen durch Kollagenase-Injektion in das Kniegelenk induziert. Mäuse wurden mit einer oder zwei IA oder vier intramuskulären Injektionen (IM) von ARA 3000 BETA behandelt. Bei der Opferung wurden Kniegelenke zur Knorpelanalyse mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) und zur Knochenanalyse mittels Mikrocomputertomographiesystem geborgen. Die histologische Bewertung der Arthrose erfolgte nach der Safranin-O/Fast-Green-Färbung. Die histologische Analyse zeigte eine schützende Wirkung gegen Knorpelabbau in behandelten Kniegelenken nach IM- und IA-Verabreichung. Dies wurde von CLSM mit einer signifikanten Verbesserung aller Parameter des Gelenkknorpels bestätigt, einschließlich Dicke, Volumen und Oberflächenabbau, unabhängig vom Verabreichungsweg. Eine leichte Schutzwirkung wurde auch auf die subchondralen Knochenparameter und die Verkalkung des Kniegelenks nach IM-Verabreichung und in geringerem Maße nach zwei IA-Injektionen festgestellt. Wir haben die therapeutische Wirksamkeit von injizierbarem ARA 3000 BETA bei Arthrose mit Schutz vor Knorpel- und Knochenveränderungen nachgewiesen und damit den Beweis erbracht, dass eine klinische Umsetzung das Fortschreiten der Krankheit verzögern könnte.

Arthrose (OA) ist die häufigste chronische Gelenkerkrankung, die vor allem Finger, Knie und Hüften betrifft. Mit der Alterung der Bevölkerung nimmt die Zahl der Patienten ständig zu und auch die Kosten für die Krankheitsbehandlung steigen. Arthrose ist gekennzeichnet durch Knorpelabbau, Knochensklerose, Osteophytenbildung, Meniskus- und Bänderverkalkung sowie Synovialentzündung, die zu Gelenkschmerzen und Funktionsbeeinträchtigungen führt. Die Entwicklung von OA korreliert mit einer erhöhten Produktion der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs)-1, -3 und -13 sowie von A-Disintegrin und Metalloproteinase mit Thrombospondin-Motiven (ADAMTS)-4, -5 und von proinflammatorischen Zytokinen, einschließlich Interleukin ( IL)-1β, -6 und Tumornekrosefaktor (TNF)-α1. Derzeitige Behandlungen nutzen Schmerzmittel und nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAID), sind jedoch nur symptomatisch und werden verschrieben, um Schmerzen zu lindern und Entzündungen zu reduzieren. Da es keine wirksame Behandlung gibt, um die Krankheit zu stoppen, zielen zahlreiche Studien auf die Erforschung neuer Therapeutika ab.

In den letzten Jahrzehnten haben Nahrungsfettsäuren (FAs) aufgrund ihrer entscheidenden Rolle in essentiellen Signalkaskaden, die die Zellfunktionen und die Gewebehomöostase aufrechterhalten, großes Interesse erlangt, während eine unausgeglichene Fettzusammensetzung zu Gelenkentzündungen führen und Arthrose induzieren kann (zur Übersicht siehe 2). FAs können in gesättigte (SFAs), einfach ungesättigte Fettsäuren (MUFAs) und mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) eingeteilt werden, zu denen Omega-6 (n-6) und Omega-3 (n-3) PUFAs gehören. Es ist mittlerweile anerkannt, dass SFAs und n-6-PUFAs entzündungsfördernde Funktionen haben, wohingegen n-3-PUFAs als entzündungshemmende FAs beschrieben werden. FAs wurden in Serum, Synovialflüssigkeit, Knorpel und subchondralem Knochen gefunden, wo sie unterschiedliche Wirkungen auf Fibroblasten, Osteoblasten und Chondrozyten ausüben3,4,5. Tatsächlich wirken sich n-3-PUFAs positiv auf den Knorpelstoffwechsel aus, indem sie Entzündungsfaktoren wie Prostaglandin E2 (PGE2), Cyclooxygenase (COX)-2, IL1β, TNFα reduzieren und ADAMTS-4 und MMP senken36,7,8,9. Die vorteilhaften Auswirkungen einer n-3-PUFA-Supplementierung in der Ernährung auf das Fortschreiten der Arthrose und die Verringerung der damit verbundenen Schmerzen wurden in verschiedenen Tiermodellen nachgewiesen, beispielsweise im Mausmodell für ernährungsbedingte Fettleibigkeit10, im Mausmodell zur Destabilisierung des medialen Meniskus11,12 und im vorderen Kreuzband Banddurchtrennungsmodell bei Kaninchen13, Hunden mit Hüft- oder Kniegelenk-OA14,15,16,17 oder zu OA neigenden Dunkin-Hartley-Meerschweinchen18. Beim Menschen haben einige Studien den Zusammenhang zwischen PUFAs in der Nahrung und klinischen Anzeichen von Arthrose untersucht. Es wurde ein positiver Zusammenhang zwischen n-6-PUFAs und dem OA-Risiko beobachtet, während ein umgekehrter Zusammenhang zwischen n-3-PUFAs und Synovitis festgestellt wurde19. Es wurde auch über positive Auswirkungen von n-3-PUFAs auf Schmerzen und Funktion berichtet20,21.

Die am häufigsten vorkommenden FAs in der Synovialflüssigkeit sind Linolsäure (n-6 PUFA), Ölsäure (n-9 MUFA) und Palmitinsäure (SFA), die 80 % der gesamten FAs ausmachen7. Interessanterweise hemmte die Zugabe von Ölsäure oder Palmitinsäure in Chondrozytenkulturen die MMP1-Expression und die GAG-Freisetzung durch Knorpelexplantate, was auf eine entzündungshemmende Funktion dieser FAs schließen lässt. In den frühen 1980er Jahren wurde von der Firma LEXMOOR (Saint-Rémy-de-Provence, Frankreich) ein Copolymer aus Ölsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure namens ARA 3000 BETA als injizierbare Formulierung entwickelt. Die In-vivo-Wirkung von ARA 3000 BETA wurde erstmals bei Hunden mit OA-Patienten untersucht und zeigte eine Verringerung von Schmerzen und Lahmheit22. Es wird immer noch häufig zur Behandlung von Arthrose bei Hunden und Kühen eingesetzt. In-vitro-Studien haben die entzündungshemmenden Eigenschaften von ARA 3000 BETA auf menschliche Chondrozyten mit einer Reduzierung der Stickoxid (NO), PGE2- und MMP-Produktion und der Hemmung des NF-kB-Signalwegs23 gezeigt. In vivo reduzierte die intramuskuläre Injektion von ARA 3000 BETA einen Tag vor Beginn der entzündlichen, adjuvansinduzierten Arthritis bei Ratten die klinischen Symptome, einschließlich Ödeme, Ankylose und Gewichtsverlust23. Es liegen jedoch keine Daten vor, die die Wirksamkeit von ARA 3000 BETA gegenüber einer Placebo-Kontrolle in einem relevanten OA-Modell belegen, obwohl offenbar ein großes Interesse daran besteht, Gelenkentzündungen zu kontrollieren und die Knorpelzerstörung zu reduzieren.

Hier haben wir die therapeutische Wirkung lokaler Injektionen von ARA 3000 BETA im Kollagenase-induzierten Osteoarthritis-Modell (CIOA) bewertet, das als Referenzmodell für entzündliche Osteoarthritis beschrieben wird24,25. Das Hauptziel der Studie bestand darin, die Wirkung einer einzelnen oder wiederholten ARA 3000 BETA-Dosis im intraartikulären Raum von Kniegelenken zu bestimmen. Die intramuskuläre Verabreichung wurde als positive Kontrolle im Zusammenhang mit der aktuellen tierärztlichen Praxis bewertet. Die Wirkung des Arzneimittels wurde auf struktureller Ebene anhand quantitativer histomorphometrischer Parameter von Knorpel- und Knochengewebe mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie bzw. Mikrocomputertomographie bewertet. Die Studie wird die Grundlage für die Umsetzung von ARA 3000 BETA in die Kliniken für menschliche Arthrose bilden.

Das Copolymer von FAs ARA 3000 BETA wurde durch Kombination von Ölsäure (8,75 mg/ml), Palmitinsäure (5,4 mg/ml) und Stearinsäure (4 mg/ml) erhalten. Die Copolymerformulierung wurde vom LEXMOOR Laboratory hergestellt und geliefert.

Alle Tierversuche wurden vor Beginn der Studie von der Ethikkommission für Tierversuche des Languedoc-Roussillon, Frankreich, genehmigt (Zulassung APAFIS#5351-2016050919079187). Tierversuche wurden gemäß den europäischen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (2010/63/UE) und gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Nach der Anästhesie mit Isofluran-Gas wurden lokale Injektionen und Euthanasie durchgeführt, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren. Die Mäuse wurden in stabilen Kunststoffkäfigen in ruhigen Räumen bei 22 °C ± 1 °C, 60 % kontrollierter Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stunden-/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Die Tiere wurden nach einer Anpassungszeit von 7 Tagen eingesetzt und hatten freien Zugang zu Leitungswasser und Standardfutter in Pelletform. In-vivo-Experimente wurden an 10 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen durchgeführt, die von Janvier (St. Berthevin, Frankreich) bezogen wurden. Das Kollagenase-induzierte Osteoarthritis-Modell (CIOA) wurde durch zwei Injektionen von 1 U Kollagenase Typ VII (Sigma-Aldrich) in 5 µL Kochsalzlösung in den intraartikulären Raum des rechten Kniegelenks von Mäusen am Tag 0 und 2 mithilfe einer Spritze induziert eine 20G-Nadel, wie in25 beschrieben. Mit Kollagenase behandelte Mäuse wurden in 4 Gruppen zu je 15 Mäusen eingeteilt: (1) Mäuse erhielten 5 µL Kochsalzlösung auf intraartikulärem (IA) Weg in die rechten Kniegelenke am Tag 7 (Kontroll-OA-Gruppe) und die kontralateralen linken Kniegelenke erhielten zwei Injektionen davon Kochsalzlösung an den Tagen 0 und 2 (Kontrolle gesunder Knie); (2) Mäuse erhielten am Tag 7 zwei IA-Injektionen von 5 µL ARA 3000 BETA in das rechte Kniegelenk (Gruppe IA1); (3) Mäuse erhielten eine einzelne IA-Injektion von 5 µL ARA 3000 BETA in das rechte Kniegelenk an den Tagen 7 und 21 (Gruppe IA2) und (4) Mäuse erhielten 50 µL ARA 3000 BETA auf intramuskulärem (IM) Weg im rechten vorderen Tibialis an den Tagen 3, 11, 18 und 25 (Gruppe IM). Die Mäuse wurden in Käfigen verteilt: 10 Mäuse/Käfig aus zwei Gruppen wurden gemischt, um käfigbedingte Verzerrungen zu begrenzen. Der Nutzen, kontralaterale Knie als gesunde Kontrollknie zu bezeichnen, wurde an anderer Stelle26 berichtet und mit der von Ethikkommissionen empfohlenen Reduzierung der Tierzahl gerechtfertigt. Als OA-Kontrolle verwendeten wir die Injektion von Kochsalzlösung, da ARA 3000 BETA aus einem Polymer besteht, das gemeinsam mit seinen Hilfsstoffen formuliert wurde und eine Trennung des therapeutischen Arzneimittels von seinen Hilfsstoffen nicht ermöglicht. Mit der G*power-Software wurde berechnet, dass fünfzehn Tiere pro Gruppe erforderlich sind, um eine Signifikanz auf dem 5 %-Niveau mit einer Trennschärfe von 80 % zu demonstrieren. Die Mäuse wurden am 42. Tag eingeschläfert und die Hinterpfoten wurden geborgen und zur weiteren Analyse 48 Stunden lang bei Raumtemperatur in 4 % Formaldehyd fixiert.

Nach der Fixierung wurden die Hinterpfoten in einem Mikrocomputertomographiesystem (µCT SkyScan 1176, Bruker) gescannt. Jeder Scan wurde gemäß den folgenden Parametern durchgeführt: 0,5 mm Aluminiumfilter, 50 kV, 500 µA, Pixelgröße von 18 µm und 0,5° Drehwinkel. Die Bilder wurden dann mit der NRecon-Software (SkyScan NRecon Version 1.7.4.6, Bruker) rekonstruiert. Fehlstellungskompensation, Ringartefakte und Strahlaufhärtung wurden angepasst, um eine korrekte Rekonstruktion des gesamten Kniegelenks zu erreichen. Der Knochenabbau wurde in der subchondralen Knochenplatte und im Epiphysenbereich auf den medialen und lateralen Plateaus jeder Tibia mithilfe der CTAn-Software (Version 1.17.7.2, Bruker) quantifiziert. Osteophytenbildung und Meniskus-/Bandverkalkung wurden an gesamten Kniegelenken quantifiziert. Rekonstruierte 3D-Bilder von Kniegelenken wurden mit der Avizo Lite-Software (Version 2019.3, FEI) erstellt.

Für jede Hinterpfote wurden Tibia und Femur abgetrennt und glattes Gewebe vorsichtig entfernt, um den Gelenkknorpel freizulegen. Der Gelenkknorpel der medialen und lateralen Tibiaplateaus wurde separat in der Tiefe im XYZ-Modus mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM; TCS SP5-II, Leica Microsystems) gescannt. Die folgenden Parameter wurden zur Abbildung jeder Probe verwendet: 5 × Trockenobjektiv, UV-Laserlichtquelle (l¼ 405 nm), Detektorverstärkung von 800 V und Liniendurchschnitt von 5. Für jede Probe wurde alle 5 µm Tiefe eine Knorpelautofluoreszenz erfasst. Der resultierende Bildstapel wurde verwendet, um 3D-Bilder jedes Plateaus zu rekonstruieren, die analysiert wurden, um das Volumen, die Dicke und den Oberflächenabbau des Gelenkknorpels quantitativ zu bewerten. Die Beurteilung der morphometrischen Parameter des Knorpels wurde sowohl in den lateralen als auch in den medialen Plateaus jeder Tibia mit der Avizo Lite-Software (Version 2019.3, FEI) durchgeführt.

Nach der CLSM-Analyse wurden die Tibias eine Woche lang in 5 %iger Ameisensäure bei Raumtemperatur entkalkt und für die Histologie aufbereitet. Die Proben wurden in Paraffin eingebettet und Frontalschnitte wurden geschnitten (3 Scheiben von 7 µm je 100 µm; erster Schnitt 50 µm unter der Knorpeloberfläche) und mit Safranin O/Fast Green angefärbt, um Knorpel- und Knochengewebe zu analysieren. Die Verschlechterungen wurden für die lateralen und medialen Tibiaplateaus mithilfe des modifizierten Pritzker-OARSI-Scores quantifiziert, indem jede Verschlechterung wie beschrieben eingestuft und gestaffelt wurde27. Drei Abschnitte jeder Probe wurden bewertet und der Probe wurde die maximale Punktzahl zugewiesen. Der minimale Wert liegt bei 0, was auf das Fehlen von Knorpel- oder Knochenschäden hinweist, wohingegen 30 der maximale Wert ist, der auf einen erheblichen Knorpel- und Knochenabbau hinweist.

Statistische Analysen, Diagramme und erstellte Bilder wurden mit der GraphPad Prism 9-Software durchgeführt. Normalverteilung und Varianzhomogenität der Werte wurden mit dem Shapiro-Wilk- und Fisher-Test und anschließendem ungepaarten t-Test bestimmt. Die statistische Analyse verglich gesunde und behandelte Gruppen mit der Arthrose-Kontrollgruppe. Die Daten werden als Mittelwert + SEM dargestellt, mit p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***), p < 0,0001 (****).

Die therapeutische Wirkung von ARA 3000 BETA wurde nach lokaler Injektion, entweder über den IA- oder IM-Weg, im CIOA-Mausmodell bewertet. Der IM-Weg wird derzeit in der Tierarztpraxis eingesetzt und bietet die Vorteile eines einfachen Zugangs und möglicher wiederholter Injektionen. Die lokale IA-Verabreichung ist der bevorzugte Weg zur OA-Behandlung und ermöglicht eine bessere Zugänglichkeit des Arzneimittels. Wiederholte Injektionen können jedoch schädlich sein, wenn sie an kleinen Gelenken wie bei der Maus angewendet werden. Wir verglichen daher die Wirkung von einer (IA1) oder zwei IA (IA2) Injektionen von ARA 3000 BETA und vier wiederholten IM-Injektionen auf OA-Parameter. Die histologische Analyse ist die Referenzmethode zur Visualisierung und Quantifizierung des Knorpelabbaus durch Zuweisung eines OA-Scores, der mit dem Grad der Knorpelveränderungen ansteigt (Abb. 1A). Hier stieg der OA-Score in den tibialen lateralen Plateaus der OA-Kniegelenke im Vergleich zu gesunden Kontrollgelenken signifikant an (Abb. 1B). Der Knorpelabbau war auf den lateralen Tibiaplateaus offensichtlicher als auf den medialen Tibiaplateaus, die keine signifikante Veränderung zeigten. Bei OA-Kniegelenken, die mit ARA 3000 BETA behandelt wurden, wurde sowohl nach IM-Verabreichung als auch nach IA-Injektion eine schützende Wirkung gegen Knorpelabbau beobachtet, was sich in einem niedrigeren OA-Score im lateralen Plateau und im gesamten Gelenk zeigt, mit einer ähnlichen Tendenz auf dem medialen Plateau (Abb . 1A,B). Die signifikantesten Ergebnisse wurden jedoch nach IM-Verabreichung und einer IA-Injektion im lateralen Plateau erzielt.

ARA 3000 BETA verbesserte die histologischen OA-Scores. (A) Histologische Bilder von gesunden (H) Mäusen und CIOA-Mäusen, die nicht behandelt (OA) oder mit vier intramuskulären (IM) Injektionen oder einer (IA1) oder zwei intraartikulären (IA2) Injektionen von ARA 3000 BETA (Ara) behandelt wurden ). (B) OA-Score der histologischen Abschnitte der lateralen oder medialen Tibiaplateaus oder der mittlere Score der Kniegelenke. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01 (Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Posttest im Vergleich zur OA-Kontrolle; n = 15 Mäuse/Gruppe).

Eine Einschränkung der histologischen Analyse ist die 2D-Visualisierung einer begrenzten Anzahl von Abschnitten des Kniegelenks, die keine genaue quantitative Analyse des Gelenkknorpels in einer gesamten 3D-Kartographie ermöglicht. Um diese Einschränkung zu umgehen, führten wir eine histomorphometrische Analyse der lateralen und medianen Tibiaknorpelplateaus mittels CLSM durch. Repräsentative 3D-Bilder der seitlichen Tibiaplateaus verdeutlichten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen erhebliche Knorpeldegradationen in OA-Kniegelenken, wie durch große Bereiche mit blauen und grünen Farben dargestellt, die auf eine geringe Dicke hinweisen (Abb. 2A). Die histomorphometrische Analyse der beiden Tibiaplateaus bestätigte eine Abnahme der Dicke und des Volumens des Gelenkknorpels, während der Oberflächenabbau in OA-Kniegelenken zunahm, jedoch keine signifikante Bedeutung erreichte (Abb. 2B). Interessanterweise zeigten OA-Mäuse, die entweder auf IM- oder IA-Weg mit ARA 3000 BETA behandelt wurden, eine signifikante Verbesserung aller Parameter des Gelenkknorpels, einschließlich Dicke, Volumen und Oberflächenabbau, im Vergleich zu nicht behandelten OA-Kniegelenken (Abb. 2A, B). ). Es wurde kein Unterschied zwischen Mäusen beobachtet, die mit einer einzelnen oder zwei IA-Injektionen von ARA 3000 BETA behandelt wurden, während bei Mäusen, denen IA injiziert wurde, im Vergleich zu IM-Verabreichung ein Trend zu einer höheren Knorpelkonservierung festgestellt wurde (Abb. 2B). Die chondroprotektive Wirkung von ARA 3000 BETA wurde somit unabhängig vom Verabreichungsweg bestätigt.

ARA 3000 BETA schützte den Gelenkknorpel vor Abbau. (A) Repräsentative 3D-rekonstruierte Bilder des seitlichen Schienbeinknorpels von gesunden (H) Mäusen und CIOA-Mäusen, die nicht behandelt (OA) oder mit vier intramuskulären (IM) Injektionen oder einer (IA1) oder zwei intraartikulären (IA2) Injektionen behandelt wurden von ARA 3000 BETA (Ara) nach CLSM-Analyse. Links Farbcode für die Knorpeldicke. (B) Histomorphometrische Analyse von 3D-Bildern des Gelenkknorpels zur Messung von Dicke, Volumen und Oberflächenabbau. Die Ergebnisse werden als Mittelwert der Tibia- und Medianplateaus ± SEM ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01; ****p < 0,0001 (ANOVA-Test mit Dunett-Posttest im Vergleich zur OA-Kontrolle; n = 15 Mäuse/Gruppe).

Arthrose gilt nicht mehr als Knorpelerkrankung, sondern als Erkrankung, die alle Kompartimente des Kniegelenks und insbesondere die Knochen betrifft. Die Wirkung von ARA 3000 BETA wurde daher mittels µCT auf histomorphometrische Parameter verschiedener tibialer Knochenregionen analysiert: subchondrale Knochenplatte und Epiphyse. Wir beobachteten eine Sklerose der Epiphysenregion bei OA-Kniegelenken im Vergleich zu gesunden Kniegelenken, die hauptsächlich im medialen Kompartiment lokalisiert war und mit einem Trend zu einem erhöhten epiphysären Knochenvolumen korrelierte (Abb. 3A, B). Obwohl dies nicht signifikant war, waren OA-Kniegelenke, die mit einer IM- oder zwei IA-Dosierung von ARA 3000 BETA behandelt wurden, tendenziell vor epiphysärer Sklerose geschützt. Auf subchondraler Knochenebene beobachteten wir eine Abnahme des Knochenvolumens und der Knochendicke sowie einen signifikanten Anstieg des Knochenoberflächenabbaus (BS/BV-Parameter) bei OA-Kniegelenken im Vergleich zu gesunden Kniegelenken (Abb. 3B). Das subchondrale Knochenvolumen war in allen behandelten Gruppen im Vergleich zu OA-Kniegelenken höher, statistische Signifikanz wurde jedoch nur mit einer einzigen ARA 3000 BETA IA-Injektion erreicht. Wir stellten auch einen Trend zu einem geringeren Abbau der Knochenoberfläche in allen behandelten Gruppen fest, unabhängig von der Art und Anzahl der Injektionen (Abb. 3B). Die Osteophytenbildung ist ein weiteres Kennzeichen von Arthrose, gemessen an einer hochsignifikanten Zunahme des Knochenvolumens und der Knochenoberfläche an den Rändern des Gelenkknorpels in Arthrose-Kniegelenken (Abb. 3C). In den mit ARA 3000 BETA behandelten Kniegelenken wurde keine signifikante Verringerung der Osteophytengröße beobachtet, obwohl nach IM- oder zwei IA-Gaben ein Trend zu geringerem Volumen und geringerer Oberfläche zu beobachten war.

ARA 3000 BETA schützte den Knochen vor OA-assoziierten Veränderungen. (A) Repräsentative Bilder von Kniegelenk-Knochengeweben bei gesunden (H) Mäusen und CIOA-Mäusen, die nicht behandelt (OA) oder mit vier intramuskulären (IM) Injektionen oder einer (IA1) oder zwei intraartikulären (IA2) Injektionen behandelt wurden ARA 3000 BETA (Ara) nach Mikro-CT-Analyse. (B) Histomorphometrische Analyse des Epiphysenknochenvolumens (BV), das auf Sklerose hinweist, des subchondralen Knochenvolumens (BV), der Dicke und der Parameter Knochenoberfläche/Knochenvolumen (BS/BV), was auf eine Knochenoberflächenveränderung an der Schnittstelle zum Knorpel hinweist. (C) Histomorphometrische Analyse des Osteophytenknochenvolumens (BV) und der Oberfläche (BS) an den Knorpelrändern in Kniegelenken. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt; *p < 0,05; **p < 0,01 (ANOVA-Test mit Dunn-Posttest im Vergleich zur OA-Kontrolle; n = 15 Mäuse).

Schließlich wurde bei OA-Kniegelenken im Vergleich zu gesunden Kniegelenken eine abnormale Verkalkung der Menisken sowie der lateralen und medianen Bänder beobachtet (Abb. 4A). Dies wurde durch einen signifikanten Anstieg der Knochenvolumen- und Oberflächenparameter (BV bzw. BS) bestätigt, die die Verkalkung dieser nicht mineralisierten Gewebe charakterisieren (Abb. 4B). Bemerkenswert ist, dass die BV- und BS-Parameter in OA-Kniegelenken, die mit ARA 3000 BETA behandelt wurden, entweder nach einer IM- oder zwei IA-Injektionen signifikant niedriger waren. Insgesamt zeigten die Daten eine schützende Wirkung von ARA 3000 BETA auf das subchondrale Knochenvolumen nach einer IA-Injektion und auf die Verkalkung des Kniegelenks nach IM-Verabreichung und zwei IA-Injektionen.

ARA 3000 BETA schützte die Weichteile des Kniegelenks vor OA-assoziierter Verkalkung. (A) Repräsentative 3D-rekonstruierte Bilder von Kniegelenken bei gesunden (H) Mäusen und CIOA-Mäusen, die nicht (OA) oder mit vier intramuskulären (IM) Injektionen oder einer (IA1) oder zwei intraartikulären (IA2) Injektionen behandelt wurden ARA 3000 BETA (Ara) nach Mikro-CT-Analyse mit mineralisierten Menisken und Außenbändern. (B) Histomorphometrische Analyse des Knochenvolumens (BV) und der Oberfläche (BS) mineralisierter Gewebe in Kniegelenken. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt; *p < 0,05; ***p < 0,001 (ANOVA-Test mit Dunn's Post-Test im Vergleich zur OA-Kontrolle; n = 15 Mäuse).

Hier haben wir gezeigt, dass ARA 3000 BETA stark vor Gelenkknorpelabbau schützt, während seine Wirkung auf Knochenveränderungen im CIOA-Mausmodell, das repräsentativ für entzündliche Arthrose ist, geringer war. Während die Studie nicht extrapolieren kann, welche Wirkung ARA 3000 BETA auf andere Pathotypen der Krankheit haben könnte, kann davon ausgegangen werden, dass die behauptete entzündungshemmende Wirkung auch bei anderen Pathotypen beobachtet werden könnte, bei denen eine Entzündung beobachtet wird. Dieser Schutzeffekt wurde nicht nur bei der standardmäßigen histologischen Analyse repräsentativer Kniegelenkabschnitte, sondern dank CLSM- und µCT-Technologien auch bei der genauen histomorphometrischen Analyse ganzer Gewebe festgestellt.

In der vorliegenden Studie wurde hervorgehoben, dass der IA-Weg der effizienteste für den Knorpelerhalt ist, während sowohl die IA- als auch die IM-Verabreichung tendenziell die epiphysäre Sklerose und die subchondralen Knochenparameter verbessert und die Verkalkung des Meniskus und des periartikulären Bandes verringert. Tatsächlich war eine einzelne IA-Injektion von 5 µL ARA 3000 BETA am Tag 7 wirksam, um den Knorpelabbau für mindestens die 5 Wochen der Nachbeobachtungszeit zu reduzieren. Im Vergleich dazu führten die vier IM-Injektionen von 50 µL ARA 3000 BETA zu einer weniger signifikanten Verbesserung der Knorpelparameter, was darauf hindeutet, dass lokale Injektionen effizienter waren. Durch CLSM-Analyse beobachteten wir eine höhere Dicke und ein höheres Volumen des Gelenkknorpels in behandelten Kniegelenken im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen, was auf eine mögliche regenerative Wirkung von ARA 3000 BETA schließen lässt. Dieses Ergebnis wurde jedoch nicht durch eine histologische Analyse validiert, die geringfügige Läsionen in gesunden Kniegelenken ergab, wie durch den mittleren OA-Score angezeigt. Das Auftreten von Läsionen in den kontralateralen Kniegelenken wurde bereits in OA-Mausmodellen beschrieben28,29. Dies deutet darauf hin, dass ARA 3000 BETA den Knorpel vor Abbau schützt, aber keine Regeneration induziert. Die leichte knochenschützende Wirkung von ARA 3000 BETA wurde hauptsächlich bei der Erhaltung des Knochenvolumens nach einer einzelnen IA-Verabreichung beobachtet, während zwei IA-Injektionen wirksamer waren, um intraartikuläre Verkalkungen zu reduzieren. Wir injizierten mit IM ein 20-fach größeres Volumen der Verbindung als mit IA, was wahrscheinlich die Wirksamkeit der Behandlung erklärt. Sowohl IM- als auch IA-Verabreichungswege werden häufig verwendet, um Medikamente bei verschiedenen Modellen von Arthrose, Osteonekrose, Osteoporose und Knochenverletzungen effizient zu verabreichen30,31,32,33,34. Die vorliegende Studie unterstreicht daher das Interesse der Verabreichung niedriger Dosen von ARA 3000 BETA und IA zum Schutz des Knorpels und in geringerem Maße der Knochen vor OA-bedingten Veränderungen.

Dies ist die erste Studie, die die vorteilhafte Rolle einer injizierbaren FA-Formulierung bei Arthrose zeigt. Frühere Studien berichteten über eine therapeutische Wirkung von ARA 3000 BETA in einer placebokontrollierten Studie an entzündlicher, durch Adjuvans induzierter Arthritis bei Ratten, was auf eine entzündungshemmende Wirkung schließen lässt23. Zwei Studien haben auch ermutigende Ergebnisse nach drei IM-Injektionen von ARA 3000 BETA im Abstand von einer Woche bei 20 und 22 Patienten mit Arthrose berichtet22,35. Der Tierarzt stellte eine Verbesserung der Schmerzen und der Funktion fest, ohne dass sich die strukturellen radiologischen Parameter verbesserten. Da jedoch keine Placebo-Kontrollen durchgeführt wurden, konnte die Wirksamkeit von ARA 3000 BETA nicht nachgewiesen werden. Bisher wurde die therapeutische Wirkung von FAs auf das Fortschreiten der Arthrose in Tiermodellen durch Nahrungsergänzung untersucht36. Eine Nahrungsergänzung mit Omega-3-PUFA-reichem Fischöl verbesserte bei Hunden mit Arthrose die Lahmheit, die Funktionsbeeinträchtigung und verringerte die Beschwerden im Vergleich zu Hunden mit normaler Ernährung14,16,37,38. Im Gegensatz dazu berichtete die bevölkerungsbasierte NEO-Studie über einen positiven Zusammenhang zwischen SFA- und PUFA-Plasmakonzentrationen und klinisch definierter Hand-OA und struktureller Knie-OA bei Männern, nicht jedoch bei Frauen39. Dies ist die erste Studie, die den Zusammenhang zwischen FA-Spiegeln und klinischer oder struktureller OA bei Tieren untersucht und durch weitere Studien bestätigt werden muss. Durch die Verwendung einer injizierbaren Formulierung von drei FAs, die ARA 3000 BETA enthalten, haben wir gezeigt, dass die IM- oder IA-Verabreichung von FAs die histologischen und strukturellen Anzeichen von OA verbessert. Darüber hinaus liefert die weit verbreitete Verwendung von ARA 3000 BETA in der Tierarztpraxis bei Hunden mit OA Belege für die positive Wirkung des Arzneimittels, ohne dass Nebenwirkungen gemeldet wurden (https://lexmoor.com). Bei Hunden wurde über ein vorübergehendes Schmerzempfinden zum Zeitpunkt der Injektion und eine leichte Schwellung an der Injektionsstelle berichtet. Auf makroskopischer Ebene ergab die vorliegende Studie eine leichte Schwellung des Muskels, die wahrscheinlich mit dem Injektionsvolumen zusammenhängt, es wurden jedoch nach der Behandlung keine Verhaltensschmerzen beobachtet. Daher liefert die vorliegende Studie den Proof-of-Concept, dass eine Übertragung auf den Menschen denkbar wäre.

Obwohl der Wirkungsmechanismus von ARA 3000 BETA nicht geklärt ist, wurde seine chondroprotektive Wirkung an primären menschlichen Chondrozyten nachgewiesen, die geringere Mengen an MMP-1, MMP-3, MMP-13, NO und PGE223 freisetzten. Ähnliche Daten wurden nach der Inkubation von Ölsäure- und Palmitin-FAs auf Chondrozyten und Knorpelexplantaten von OA-Patienten berichtet7. Öl- und Palmitinsäure wurden von den Zellen aufgenommen und unter entzündlichen Bedingungen wurde eine verringerte Expression von MMP1 und Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase 2 (PTGS2) sowie eine geringere Freisetzung von Glykosaminoglykanen (GAG) beobachtet. Bezüglich der Auswirkungen von FAs auf den Knochen wurden gegenteilige Auswirkungen auf die Osteoklastogenese beschrieben. SFAs wie Palmitinsäure fördern die RANKL-induzierte Osteoklastogenese, während n-9-MUFAs wie Ölsäure diesen Prozess durch Aktivierung von Diacylglycerolacyltransferase 1 (DGAT1) verhindern, einem Enzym, das an der Triglyceridsynthese beteiligt ist2,40. Abhängig von der relativen Konzentration jeder Verbindung in der Formulierung kann sich das Gesamtgleichgewicht zwischen pro- und antiosteoklastogenen Wirkungen wahrscheinlich in Richtung Knochenschutz/-regeneration verschieben. Abgesehen von entzündungshemmenden und knochenerhaltenden Eigenschaften könnte die ARA 3000 BETA-Formulierung und ihre inhärente Viskosität im intraartikulären Raum durch einen viskosupplementierenden Effekt wirken. Dies wurde nicht untersucht, erfordert aber weitere Studien an größeren Tieren.

Zusammenfassend konnten wir die therapeutische Wirksamkeit von ARA 3000 BETA, einem injizierbaren FA-Copolymer, bei entzündlicher Arthrose mit einem signifikanten Schutz vor Gelenkknorpel- und Knochenläsionen nachweisen. Wir haben die klinische Wirksamkeit der Verabreichungswege IM und IA validiert, IA-Injektionen könnten jedoch bevorzugt werden, da eine einzelne niedrige Dosis den Knorpel wirksam vor Veränderungen schützt. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, um den Wirkungsmechanismus von ARA 3000 BETA und seine Rolle in den an OA beteiligten Signalkaskaden zu verstehen, liefern unsere Ergebnisse den Proof-of-Concept, dass eine klinische Umsetzung das Fortschreiten der Krankheit stoppen oder verzögern könnte.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Pers, YM, Ruiz, M., Noel, D. & Jorgensen, C. Mesenchymale Stammzellen zur Behandlung von Entzündungen bei Arthrose: Stand der Technik und Perspektiven. Osteoarthr. Knorpel 23(11), 2027–2035 (2015).

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Wir danken der histologischen Einrichtung Réseau d'Histologie Expérimentale de Montpellier für die Gewebeverarbeitung. Wir danken auch der „SMARTY-Plattform und dem Netzwerk der Tiereinrichtungen von Montpellier“.

Die Arbeit wurde vom LEXMOOR Laboratory (Saint Rémy de Provence, Frankreich) finanziert. Die Studie wurde von der nicht-klinischen Modellplattform ECELLFRANCE (Montpellier, Frankreich) durchgeführt, die keine Beeinträchtigung des Studiendesigns, der Analyse und der Interpretation anerkennt.

IRMB, Universität Montpellier, INSERM, Montpellier, Frankreich

Karine Toupet, Christian Jorgensen und Danièle Noël

ECELLFRANCE, Universität Montpellier, INSERM, CHU Montpellier, Montpellier, Frankreich

Karine Toupet, Christian Jorgensen und Danièle Noël

Therapeutische Abteilung für klinische Immunologie und osteoartikuläre Erkrankungen, Hôpital Lapeyronie, Montpellier, Frankreich

Christian Jorgensen & Danièle Noël

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KT: experimentelle Arbeit, Datenanalyse, Manuskripterstellung; CJ: Experimentdesign; DN: Experimentdesign, Datenanalyse, Verfassen von Manuskripten. Alle Autoren waren an der kritischen Überarbeitung des Manuskripts beteiligt und stimmten der endgültigen Fassung zu.

Korrespondenz mit Danièle Noël.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Toupet, K., Jorgensen, C. & Noël, D. Ein injizierbares Copolymer aus Fettsäuren (ARA 3000 BETA) als vielversprechende Behandlung für Arthrose. Sci Rep 13, 7783 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34206-8

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Eingegangen: 10. Januar 2023

Angenommen: 26. April 2023

Veröffentlicht: 13. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34206-8

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