Starkes Acyl

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1455 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Identifizierung, wie kleine Moleküle bei der Abtötung von Malariaparasiten wirken, kann zu neuen „chemisch validierten“ Zielen führen. Indem wir Parasiten im asexuellen Blutstadium von Plasmodium falciparum mit drei neuartigen, strukturell nicht verwandten Antimalariaverbindungen (MMV665924, MMV019719 und MMV897615) unter Druck setzen und eine Analyse der Gesamtgenomsequenz an resistenten Parasitenlinien durchführen, identifizieren wir mehrere Mutationen in der Acyl-CoA-Synthetase von P. falciparum ( ACS)-Gene PfACS10 (PF3D7_0525100, M300I, A268D/V, F427L) und PfACS11 (PF3D7_1238800, F387V, D648Y und E668K). Allelersatz und thermisches Proteomprofil bestätigen, dass PfACS10 ein Ziel dieser Verbindungen ist. Wir zeigen durch bedingtes Knockdown, dass dieses Protein für das Parasitenwachstum essentiell ist, und beobachten eine erhöhte Anfälligkeit für Verbindungen bei reduzierter Expression. Die Hemmung von PfACS10 führt zu einer Reduzierung der Triacylglycerine und einem Aufbau seiner Lipidvorläufer, was wichtige Einblicke in seine Funktion liefert. Die Analyse des PfACS11-Gens und seiner Mutationen weist auf eine Rolle bei der Vermittlung von Resistenzen über eine verringerte Proteinstabilität hin.

Trotz bemerkenswerter Fortschritte bei der Eliminierung der Malaria schätzt der Welt-Malaria-Bericht 2022, dass im Jahr 2021 247 Millionen neue Fälle und 619.000 Todesfälle auf Malaria zurückzuführen sind1. Zur Behandlung der Krankheit wird eine begrenzte Anzahl von Antimalaria-Arzneimittelklassen eingesetzt und es besteht ein gewisses Maß an Resistenz gegen nahezu jedes therapeutische Mittel ist in zumindest einigen Populationen des Parasiten Plasmodium falciparum in Endemiegebieten aufgetreten. Die Identifizierung neuer Antimalariamittel, die auf neuartige Wege abzielen, ist für die Erweiterung des Repertoires verfügbarer Medikamente von entscheidender Bedeutung.

Im letzten Jahrzehnt wurden in phänotypischen Tests mehr als 5 Millionen Verbindungen gegen P. falciparum getestet und über 25.000 Treffer mit niedriger oder submikromolarer Aktivität identifiziert2,3,4,5,6,7. Die Identifizierung chemisch validierter Ziele dieser erfolgreichen Verbindungen kann den Einsatz leistungsstarker Ansätze wie strukturgesteuerter Arzneimittelentwicklung, Fragment-Screening oder DNA-kodierter Bibliotheken katalysieren, um die Entdeckung und Entwicklung von Malariamedikamenten zu beschleunigen. Das Malaria Drug Accelerator-Konsortium (MalDA) versucht, mithilfe eines chemogenomischen Ansatzes8 neuartige Wirkstoffziele in P. falciparum zu identifizieren, wobei der Schwerpunkt auf kleinen Molekülen liegt, die im phänotypischen Screening ganzer Zellen als Treffer identifiziert wurden. Eine Hauptstrategie dieses Konsortiums besteht darin, die In-vitro-Evolution resistenter Parasiten und die Hochdurchsatz-Sequenzierung der nächsten Generation anzuwenden, wodurch mehrere neue Ziele und Resistenzmechanismen identifiziert wurden9,10,11,12.

Hier nutzen wir frühere Berichte über In-vitro-Experimente zur Resistenzentwicklung mit drei unterschiedlichen chemischen Gerüsten (MMV665924, MMV019719 und MMV897615), um neue Einblicke in die Wirkstoffzielkandidaten PfACS10 und PfACS11 zu gewinnen, konservierte Mitglieder der Acyl-CoA-Synthetase (PfACS) von P. falciparum. Enzymfamilie8,12,13. PfACS-Enzyme sind den langkettigen Fettsäuresynthetasen (ACSLs) am ähnlichsten, die freie Fettsäuren (FA) einer bevorzugten Acylkette von 12–20 aktivieren, indem sie sie in einem zweistufigen, ATP-abhängigen Prozess an Coenzym A koppeln , was zu Acyl-CoA14 führt. Eukaryotische ACSLs bevorzugen bestimmte FA-Substratlängen und Sättigungsgrade15,16,17,18. Parasiten fangen FAs vom Wirt ab19,20 und die Aktivierung von FAs durch PfACSs ermöglicht es ihnen, in verschiedene Lipidspezies eingebaut zu werden, die für das Parasitenwachstum essentiell sind. Dazu gehört die Ansammlung neutraler Lipide (Triacylglycerine und Diacylglycerine) in Lipidtröpfchen21,22.

Mithilfe von Allelersatz und thermischem Proteom-Profiling liefern wir hier den Beweis, dass PfACS10 ein essentielles Protein und das Ziel von MMV665924, MMV019719 und MMV897615 ist. Die Hemmung von PfACS10 führt zu einer Verringerung der Triacylglycerine und einem Aufbau seiner Lipidvorläufer. Während andererseits der allelische Ersatz von Mutationen in PfACS11 die ausgewählten Linien phänokopiert, zeigen unsere bedingten Knockdown-Daten, dass PfACS11 für das asexuelle Parasitenwachstum nicht essentiell ist, was darauf hindeutet, dass PfACS11 möglicherweise Resistenz vermittelt und kein direktes Ziel ist.

Frühere Arbeiten des MalDA-Konsortiums identifizierten MMV019719 und MMV665924 als zwei neue phänotypische Treffer aus der chemisch vielfältigen Malaria Box von Medicines for Malaria Venture (MMV)8,12. Resistenzselektionen mit MMV665924 führten zu Mutationen in zwei neuen mutmaßlichen Zielen in der P. falciparum-Acyl-CoA-Synthetase (PfACS)-Enzymfamilie: PfACS10 (PF3D7_0525100, M300I) und PfACS11 (PF3D7_1238800, D648Y und E668K). Selektionen mit MMV019719 führten zu einer einzelnen Mutation in PfACS11 (F387V). Um die Rolle dieser Mutationen bei der Verleihung einer Resistenz gegen diese beiden Verbindungen zu überprüfen (Resistenz wird hier als eine mehr als zweifache Verschiebung der EC50-Werte in der In-vitro-Kultur im Vergleich zur Elternlinie definiert), verwendeten wir die CRISPR/Cas9-Technologie zur Allelanalyse Ersetzungen einer Teilmenge der beobachteten Mutationen (Ergänzungsabbildung 1 und Ergänzungstabelle 1). Unter Verwendung der 3D7-Elternlinie führten wir die einzelnen Punktmutationen F387V oder E668K in PfACS11 und M300I in PfACS10 ein, wodurch die geneditierten Linien ACS11F387V_C, ACS11E668K_C und ACS10M300I_C entstanden. Diese Parasiten kopierten den Anstieg der EC50-Werte, der bei medikamentös ausgewählten Parasiten im Vergleich zu Wildtyp-Parasiten beobachtet wurde (Abb. 1a – c und ergänzende Daten 1). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die durch Resistenzselektionen mit MMV019719 und MMV665924 identifizierten Mutationen in PfACS10 und PfACS11 ausreichen, um die Anfälligkeit für diese Verbindungen zu verringern. Ein Kreuzresistenz-Screening ausgewählter und CRISPR-editierter Parasitenlinien ergab, dass sowohl E668K als auch F387V in PfACS11 eine ähnliche Verringerung der Anfälligkeit für Parasitenlinien bewirkten, die mit MMV019719 und MMV665924 ausgewählt wurden (Ergänzungsdaten 1). Im Vergleich zur Elternlinie zeigten ACS10M300I-Parasiten auch einen 2,5-fachen Anstieg der EC50 für MMV019719 (Supplementary Data 1). Wir haben weder in den ausgewählten noch in den genetisch veränderten Linien im Vergleich zum 3D7-Elternteil Veränderungen im EC50 gegenüber anderen Antimalariamitteln (Atovaquon, Amodiaquin, Mefloquin oder Chinin) festgestellt (Einfaktorielle ANOVA gefolgt von Dunnett-Posttest, Ergänzungsdaten 2). ). Diese Ergebnisse zeigen, dass PfACS10 M300I und PfACS11 E668K und F387V ausreichen, um Resistenz gegen zwei Verbindungen aus unterschiedlichen chemischen Gerüsten zu verleihen.

a Chemische Strukturen der bei der Arzneimittelauswahl verwendeten Verbindungen. b–d Dosis-Wirkungs-Kurven für ein repräsentatives Beispiel der Elternlinie 3D7 (schwarz), der ausgewählten Linien (ACS11E668K_S, ACS11F387V_S und ACS10M300I_S) und der genetisch veränderten Linien (ACS11E668K_C, ACS11F387V_C und ACS10M300I_C) gegenüber der zur Auswahl verwendeten Verbindung die widerstandsfähigen Linien. Für jeden Stamm wurden mindestens drei biologische Replikate in technischen Dreifachansätzen durchgeführt. Dargestellt sind der Durchschnitt ±SD und die nichtlineare Regressionskurve für einen dreifach durchgeführten biologischen Test. Statistische Signifikanzen für EC50 werden in den Zusatzdaten 1 angegeben und die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Kürzlich führten wir Selektionen in einer Hypermutator-P. falciparum-Linie (Dd2-Polδ23) mit MMV897615 durch, die drei neue Mutationen in PfACS10 ergab, die eine mindestens siebenfache Erhöhung der Resistenz bewirken (ACS10A268D, ACS10A268V und ACS10F427L, Abb. 2). und Zusatzdaten 1 und 3). MMV897615 (19f) ist Teil einer Reihe von Chinazolinon-2-carboxamid-Derivaten, die entwickelt wurden, um eine schnell wirkende, niedrige nanomolare Aktivität gegen Parasiten im asexuellen Blutstadium, eine mäßige Aktivität gegen Parasiten im Leberstadium und eine In-vivo-Clearance von P. falciparum in einem humanisierten Tier zu haben SCID-Mausmodell24. Wir haben getestet, ob diese Mutantenlinien auch Resistenz gegen MMV665924 und MMV019719 zeigen würden (Abb. 2 und ergänzende Daten 1). ACS10F427L_S-Parasiten zeigten fünf- bzw. 20-fach höhere EC50-Werte für MMV65924 bzw. MMV019719. Änderungen an Position 268 hatten jedoch einen differenzierteren Phänotyp. Die ACS10A268D_S-Linie zeigte keine Verschiebung der Anfälligkeit gegenüber MMV665924, war jedoch im Vergleich zur Elternlinie zehnmal anfälliger gegenüber MMV019719. Im Gegensatz dazu war die ACS10A268V_S-Linie im Vergleich zur Elternlinie zweifach anfälliger für MMV665924, aber zweifach resistenter gegen MMV019719. Diese unterschiedliche Empfindlichkeit von Mutationen gegenüber verschiedenen Verbindungen erinnert an die Kollateralempfindlichkeit, bei der eine Resistenz gegen ein Medikament die Anfälligkeit für ein anderes erhöht. Insgesamt untermauern unsere Ergebnisse zur entwickelten Resistenz gegen MMV897615 die Hypothese, dass PfACS10 ein primäres Ziel dieser Verbindungen ist.

Für MMV897615, MMV665924 und MMV019719 werden mittlere EC50 ± SD-Werte für Stämme angezeigt, die Mutationen in PfACS10 enthalten, die in der Dd2-Polδ-Linie (A268D, A268V und F427L) und in 3D7 (M300I) ausgewählt wurden. Die Tests wurden dreifach durchgeführt und mindestens zweimal wiederholt. ANOVA mit Dunnett-Posttests verglich Mutationen in der Dd2-Polδ-Linie, ap < 0,001, bp = 0,005. Zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test im Vergleich zwischen 3D7 und ACS10M300I_C. cp = 0,0003, dp = 0,0000008, ep = 0,0016. Quelldaten werden als Quelldatendatei und in den Zusatzdaten 1 bereitgestellt.

Um zu verstehen, ob in natürlichen Populationen bereits Varianten der PfACS10- und PfACS11-Gene vorhanden sind (Ergänzungsdaten 4), haben wir die Diversität innerhalb und die Divergenz zwischen Parasitenkohorten aus Malawi und Senegal verglichen (Abb. 3a). In beiden Fällen lag PfACS10 im 95. Perzentil für die paarweise Nukleotiddiversität (π) innerhalb jedes Landes sowie für die Divergenz (FST) zwischen Malawi und Senegal.

EC50 a Paarweise Nukleotiddiversität (π) und Divergenz (FST) zwischen malawischen und senegalesischen Populationen für 4614 Gene in P. falciparum. Mitglieder der ACS-Familie sind rot gekennzeichnet. Das 95. Perzentil wird durch eine gepunktete Linie angezeigt. Insgesamt ist das paarweise π von Malawi und Senegal stark korreliert (zweiseitiges Pearson R2 = 0,94, p < 1 × 10−15) und im Allgemeinen relativ niedrig (Median von 0,0003207 bzw. 0,0003214 für Senegal und Malawi). b Verteilung des nicht-synonymen Einzelnukleotidpolymorphismus mit globalem MAF > 0,01 aus global unterschiedlichen Isolaten (www.malariagen.net/pf3k). Die Länge der Balken stellt die lokale MAF jeder Variante in West- (blau) oder Ostafrika (lila) dar. Die ausgewählten Varianten werden durch rote, blaue und gelbe Pfeile angezeigt. Dunkelgrüne Kästchen zeigen die ACS-Motive an: P: P-Schleife, G: Gate-Motiv, A: Adenin-Bindungsstelle, L: Linker. c Repräsentativer Dosis-Wirkungs-Assay für eine klonale Linie von CF04.008 (ACS10 M300, grau) und zwei klonale Linien von CF04.009 (ACS10 M300I, rot) aus Malawi. Die Tests wurden dreifach durchgeführt und zweimal wiederholt. Dargestellt sind der Durchschnitt ±SD und die nichtlineare Regressionskurve für einen dreifach durchgeführten biologischen Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. MAF-Minor-Allel-Häufigkeit, paarweise π-Nukleotid-Diversität innerhalb jedes Landes, FST-Divergenz.

Unter den häufigen natürlichen Varianten (Abb. 3b) fanden wir eine Mutation, die sich auch in vitro in kultivierten Parasiten entwickelt hatte, die mit MMV665924 (ACS10M300I_S) ausgewählt wurden. Die ACS10M300I-Variante war in 78 % der Malawi-Isolate aus einem Hochübertragungsgebiet vorhanden25. Um zu testen, ob die M300I-Variante in ihrem natürlichen genetischen Hintergrund Resistenz gegen MMV665924 verleiht, haben wir kulturadaptierte Isolate aus zwei von Patienten stammenden Proben in Malawi26 hergestellt – eines enthielt keine Mutationen in PfACS10 (CF04.008) und das andere enthielt die M300I-Substitution (CF04.008). .009). Hemmende Wachstumstests geklonter Isolate zeigten einen über fünffach höheren EC50-Wert im M300I-Isolat (Abb. 3c und ergänzende Daten 1), was den Beweis liefert, dass die M300I-Variante in ihrem natürlichen genetischen Hintergrund zu einer verringerten Parasitenanfälligkeit für MMV665924 beitragen könnte.

Um die Verteilung natürlich vorkommender Varianten (Supplementary Data 4) und Resistenz-assoziierter Mutationen in den Proteinstrukturen von PfACS10 und PfACS11 zu untersuchen, verwendeten wir von Alphafold27 (https://www.alphafold.ebi.ac.uk) generierte Homologiemodelle /). Die Mutationen in PfACS10, die mit Resistenz oder Kollateralempfindlichkeit gegenüber MMV019719, MMV665926 und MMV897615 (M300I, A268D/V und F427L) verbunden sind, treten alle in einer inneren Tasche der PfACS-Proteinmodelle auf (Abb. 4), die in anderen Organismen die Acyl- Kette von FA-Substraten14,28,29,30. Mehrere natürlich vorkommende Varianten in PfACS10 (S273A, A402G, A266S) wurden auch in der Nähe der Resistenz-assoziierten Mutationen in der FA-Bindungstasche gefunden.

ein AlphaFold-Modell der Struktur von PfACS10. b Mutationen, die Resistenz gegen MMV665924 und MMV897615 verleihen, treten in der Fettsäurebindungstasche von PfACS10 auf. Die Position der Resistenz verleihenden Mutationen M300I, F427L und A268D/V ist rot dargestellt. Mehrere nicht-synonyme genetische Varianten in der MalariaGen-Pf3k-Datenbank mit hoher Nebenallelfrequenz kommen auch innerhalb der Fettsäurebindungstasche vor (A402G, S273A, A266S). c AlphaFold-Modell von ACS11. d Die F387V-Mutation (rot dargestellt) ist in der vorhergesagten Fettsäurebindungstasche des PfACS11-Proteins lokalisiert. Aminosäurepositionen mit nicht-synonymen genetischen Varianten in der Datenbank MalariaGen Pf3k (www.malariagen.net/pf3k) mit einer geringen Allelfrequenz > 0,01 sind in Orange dargestellt (Abb. 3 und Ergänzung 4). Resistenzassoziierte Mutationen sind rot dargestellt.

In PfACS11 säumt nur die F387V-Mutation die FA-Bindungstasche. Die D648Y- und E668K-Mutationen treten in benachbarten Falten auf, die der Nukleotidbindungsregion der C-terminalen Domäne von PfACS11 zugewandt sind. Zuvor berichtete PfACS11-Mutationen (E660K und K462N), bei denen festgestellt wurde, dass sie eine Resistenz gegen Pantothenamid-Bioisostere verleihen, kommen in dieser Region ebenfalls vor31,32. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Mutationen in der FA-Bindungstasche Resistenz verleihen können, indem sie die Inhibitorbindung stören.

Um zu untersuchen, ob Mutationen in PfACS10 und PfACS11 tatsächlich die Wechselwirkungen mit Inhibitoren verändern können, die die FA-Tasche binden, haben wir Triacsin C, ein mehrfach ungesättigtes FA-Mimetikum, das langkettige ACS-Enzyme in anderen Organismen hemmt, an einer Untergruppe von Parasiten getestet, die einzelne Mutationen in PfACS10 tragen ( M300I) oder PfACS11 (F387V, D648Y und E668K). Mutierte Parasiten zeigten eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber dieser Verbindung, wobei stärkere Auswirkungen auf die Mutationen PfACS10 M300I und PfACS11 F387V zurückzuführen waren, die die FA-Tasche auskleiden. Diese Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass diese Mutationen die Wechselwirkungen innerhalb der FA-Substratbindungstasche der Enzyme verändern (Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Daten 2).

Um die Rolle von PfACS10 im Resistenzmechanismus weiter zu untersuchen, verwendeten wir das TetR-DOZI-Aptamersystem33, um bedingte PfACS10-Knockdown-Parasiten (ACS10cKD) zu erzeugen. Der Entzug von Anhydrotetracyclin (aTc) führt zu verringerten Proteinspiegeln des Aptamer-markierten Gens. Es war uns jedoch nicht möglich, PfACS10 mit einem Protein-Tag zu versehen, um die Proteinreduktion unter induzierbaren Bedingungen zu messen. Dennoch wurde beobachtet, dass die Entfernung von aTc zu einem Verlust der Parasitenproliferation in der ACS10cKD-Linie führte (Abb. 5a). Diese Ergebnisse bestätigen die Essentialität von PfACS10 bei Parasiten im asexuellen Blutstadium, wie zuvor anhand eines P. berghei-Knockout-Modells nahegelegt34. Der Abbau von PfACS10 führte zu einer signifikanten Parasitenüberempfindlichkeit gegen MMV019719, MMV665924 und MMV897615 (Abb. 5b – d, ungepaarter Student-t-Test p < 0,01, ergänzende Daten 1), was mit einer hemmenden Wechselwirkung dieser Verbindungen mit PfACS10 direkt oder indirekt innerhalb dieser Verbindungen vereinbar ist Weg35.

Die bedingte Knockdown-Linie für PfACS10 wurde mit dem TetR-Aptamer-System generiert, ähnlich den zuvor generierten ACS11cKD- und YFPcKD-Linien40. Die Lebensfähigkeit der Linien wurde getestet, indem Anhydrotetracyclin (aTc) entfernt und die Parasitenproliferation durch Lumineszenz des Luciferase-Reportergens nach 72 Stunden gemessen wurde. a Der Verlust von PfACS10 führte zu einem vollständigen Wachstumsblock, wohingegen der Verlust von PfACS11 zu einem Wachstumsrückgang von 20 % führte. Dargestellt ist ein biologischer Replikatlauf in dreifacher Ausfertigung. Für Signifikanztests wurde ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test verwendet: a: p = 0,0000005, b: p = 0,012. Beispiel für Dosis-Wirkungs-Kurven für b, f MMV019719, c, g MMV665924 und d, h MMV897615, getestet in Gegenwart von hohem aTc (50 nM) oder niedrigem aTc (5 nM aTc für ACS10cKD, um minimales Wachstum zu ermöglichen), oder kein aTc für ACS11cKD und YFPcKD. ACS10cKD-Parasiten waren bei niedrigem aTc deutlich anfälliger für alle Verbindungen als bei hohem aTc. Dargestellt sind der Durchschnitt ±SD und die nichtlineare Regressionskurve für einen dreifach durchgeführten biologischen Test. Im Gegensatz dazu waren ACS11cKD-Parasiten in Abwesenheit von aTc weniger anfällig für die Verbindungen, wohingegen die aTc-Konzentration keinen Einfluss auf die YFPcKD-Linie hatte. Statistische Signifikanzen für EC50 werden in den Zusatzdaten 1 angegeben und die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Gelb fluoreszierendes YFP-Protein, aTc-Anhydrotetracyclin.

Um festzustellen, ob PfACS10 ein direktes Ziel der Verbindungen ist oder anderweitig an einem Resistenzmechanismus beteiligt ist, verwendeten wir thermisches Proteom-Profiling (TPP), eine effektive und unvoreingenommene Methode zum Nachweis der Verbindung zwischen Verbindung und Ziel. Dieser Ansatz basiert auf dem Prinzip, dass die Bindung eines Medikaments an sein Proteinziel die thermische Stabilität dieses Proteins erheblich verändern kann36. Hier verwendeten wir eine Ganzzellversion von TPP, um die molekularen Ziele von MMV897615 zu identifizieren, indem wir kultivierte Parasiten vor der Zelllysatvorbereitung eine Stunde lang mit 500 nM MMV897615 oder DMSO-Vehikel behandelten. Wir haben vollständige Schmelzkurven für 2311 Proteine ​​über den Temperaturbereich von 37 °C bis 72 °C erstellt, was einer Abdeckung von >43 % des P. falciparum-Proteoms entspricht. Im Vergleich zu früheren TPP- und zellulären thermischen Verschiebungstests in Verbindung mit Massenspektrometriestudien (MS-CETSA) mit P. falciparum37,38 ist dies ein guter Abdeckungsgrad. TPP-Datensätze wurden mit der auf der Standardschmelztemperatur (Tm) basierenden Methode analysiert, wie in einer früheren TPP-Veröffentlichung39 beschrieben. Diese Analyse bewertet einzelne Proteinschmelzkurven anhand mehrerer Kriterien, darunter Kurve R2, Variabilität der Tm-Werte innerhalb der Kontrollprobe, maximales Kurvenplateau und minimale Steigung. Anschließend werden für jedes nachweisbare Protein Schmelzpunktunterschiede (ΔTm = Tm, behandelt – Tm, Kontrolle) ermittelt. Durch Anwendung eines FDR-bereinigten Z-Tests auf ΔTm-Daten werden nur die am stärksten betroffenen Proteine ​​als potenzielle „Treffer“ ausgewählt. Proteine ​​mit einem p-Wert <0,1 in zwei separaten technischen Replikaten gelten als „Hits“. Treffer, die in zwei biologischen Nachbildungen gefunden wurden, gelten als mutmaßliche Ziele.

Die Analyse unserer TPP-Datensätze ergab 14 „Treffer“ im ersten biologischen Replikat und 10 im zweiten (Supplementary Data 5). Das einzige Protein, das in beiden Datensätzen als mutmaßliches Ziel identifiziert wurde, war jedoch PfACS10 (Abb. 6). Andere PfACS-Enzyme wurden in unseren TPP-Datensätzen erfolgreich identifiziert; ihre thermische Stabilität blieb in Gegenwart von MMV897615 unverändert. Da die Tm-Methode den strengsten und robustesten Ansatz zur „Treffer“-Identifizierung darstellt, haben wir ein hohes Maß an Vertrauen, dass PfACS10 direkt mit MMV897615 interagiert.

ein Venn-Diagramm von Proteinen, die die signifikantesten thermischen Verschiebungen in Gegenwart von MMV897615 aus Doppelexperimenten (biologische Replikate) zeigen. b Schmelzkurve für PfACS10 nach Inkubation mit 500 nM MMV897615 oder Vehikel (0,1 % DMSO) in den beiden unabhängigen Experimenten. Die mittlere Verschiebung der Schmelztemperatur (ΔTm) für PfACS10 betrug 4,13 °C. Daten aus den beiden unabhängigen Doppelexperimenten sind in den ergänzenden Daten 5 dargestellt. c Western-Blot, der das Proteinlysat von ACS11cKD-Parasiten zeigt, die in Gegenwart von 500 nM aTc kultiviert wurden. Proteinlysate wurden entweder 30 Minuten lang bei Raumtemperatur jeweils 10 mM MMV665924 und MMV019719 (+) oder Kontroll-DMSO (–) ausgesetzt, um die Wirkung von MMV665924 und MMV019719 auf die Proteinstabilität zu testen. Lysate wurden entweder auf einem nicht denaturierenden Gel oder auf einem SDS-Gel laufen gelassen, auf eine Membran übertragen und mit Anti-HA-Antikörpern nachgewiesen. Es konnte kein Einfluss von MMV665924 und MMV019719 auf die Dimerisierung festgestellt werden. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. aTc Anhydrotetracyclin.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Mutationen in PfACS11 eine Resistenz gegen mehrere Acetyl-CoA-Synthetase (AcAS)-Inhibitoren verleihen31,32,40 und dass PfACS11 für das in einem P. berghei-Knockout-Modell beschriebene asexuelle Parasitenwachstum im Blutstadium nicht wesentlich ist34 und a P. falciparum PiggyBac-Essentialitätsscreening41. Unsere hier berichtete Arbeit zeigt, dass Resistenz durch die von MMV665924 und MMV079179 ausgewählten Mutationen verliehen wird. Um den Resistenzmechanismus weiter zu untersuchen, haben wir die Anfälligkeit der zuvor beschriebenen ACS11cKD- und Kontroll-YFPcKD-Parasiten40 gegenüber MMV665924, MMV079179 und MMV897615 in Gegenwart oder Abwesenheit von aTc getestet. Die Reduzierung der PfACS11-Proteinspiegel führte zu einem höheren Grad an Resistenz gegen alle drei Medikamente (Student-t-Test p <0,001, Ergänzende Daten 1 und Abb. 5f – h). Interessanterweise war die ACS11cKD selbst in Gegenwart von 50 nM aTc im Vergleich zur YFP-Kontrolle zweifach resistent, möglicherweise aufgrund des HA-Tags, der zu einer Proteindestabilisierung führte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Verringerung oder Destabilisierung des PfACS11-Proteins den Resistenzmechanismus vorantreiben könnte.

Weitere Hinweise auf eine Destabilisierung ergeben sich aus der Analyse unseres TPP-Datensatzes. Die nichtparametrische Analyse von Antwortkurven (NPARC), eine alternative und möglicherweise weniger strenge Methode zur Trefferidentifizierung, zeigte, dass PfACS11 in Gegenwart von MMV897615 destabilisiert wurde (Supplementary Data 5). Im Gegensatz zur oben beschriebenen Tm-Methode zur Trefferidentifizierung berücksichtigt NPARC die gesamte Schmelzkurve und vergleicht die Anpassungsgüte der experimentellen Daten mit einem Nullmodell, das davon ausgeht, dass das Protein von der medikamentösen Behandlung nicht betroffen ist, oder einem alternativen Modell, das dies annimmt Das Protein wird durch die Behandlung beeinträchtigt. Es wird ein FDR-bereinigter p-Wert generiert, der die Bedeutung der Wirkung des Arzneimittels auf das Proteinschmelzverhalten angibt. In dieser Studie wurden Proteine ​​mit einem NPARC-p-Wert < 0,01 als „Treffer“ betrachtet und diejenigen Treffer, die beiden biologischen Replikaten gemeinsam waren, wurden als mutmaßliche Ziele betrachtet. Die Destabilisierung eines Proteins kann auf eine Störung eines Proteinkomplexes oder -dimers hinweisen. Ein Western Blot mit Proteinlysat, das unter nicht denaturierenden Bedingungen aus einer ACS11cKD-Parasitenlinie hergestellt wurde, die HA-markiertes PfACS11 exprimiert, zeigte eine Doppelbande zwischen 140 und 260 kDa, während unter denaturierenden Bedingungen eine einzelne Bande bei etwa 100 kDa vorhanden war (Abb. 6c). Dieses Ergebnis legt nahe, dass PfACS11 mit anderen Proteinen oligomerisieren oder einen Komplex bilden könnte. Um zu testen, ob PfACS11 einen Komplex mit anderen PfACS-Proteinen oder anderen Interaktionspartnern bildet, führten wir Pulldown-Experimente mit ACS11cKD-Trophozoiten durch, die HA-markiertes PfACS11 exprimieren. Die Ergebnisse zeigten keine signifikante Anreicherung für andere Proteine ​​als PfACS11 (Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Daten 6). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass PfACS11 ein potenzieller Resistenzmediator und kein direktes Ziel ist und dass die Resistenz wahrscheinlich über einen Funktionsverlust vermittelt wird.

P. falciparum-Parasiten können während der Entwicklung des asexuellen Blutstadiums ein breites Spektrum an FA-Substraten aus dem Wirt entfernen42. Daher haben wir die Auswirkung des PfACS10-Knockdowns auf die gesamte FA-Zusammensetzung infizierter Erythrozyten mithilfe der Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektion (GC-FID) getestet. Wie zuvor beobachtet43, verändert die Parasiteninvasion die FA-Zusammensetzung der Erythrozyten drastisch, wobei 60 % der FA aus nur drei FA in den parasitierten roten Blutkörperchen bestehen: 16 % Stearinsäure (18:0), 13 % Palmitinsäure (16:0). und 30 % Ölsäure (18:1n-9c) (Ergänzende Daten 7 und 8).

Nach der Entfernung von aTc kam es bei ACS10cKD-Parasiten im Vergleich zu vollständigen aTc-Kontrollen zu geringfügigen, aber signifikanten Verringerungen der Stearin-, Öl- und Elaidinsäure (18:1n-9t) (durchschnittlich 15, 5 bzw. 27 % Verringerung, ungepaarter Student-t-Test). p <0,05, Abb. 7a und ergänzende Daten 7). Diese Daten legen nahe, dass PfACS10 an der Aufnahme und Retention von FAs mit einer bevorzugten Acylkettenlänge von 18 beteiligt sein könnte.

a ACS10cKD-Parasiten wurden 24 Stunden vor der Anreicherung von Trophozoiten durch MACS-Reinigung gewaschen, um reduzierte PfACS10-Spiegel zu ermöglichen. Unter diesen aTc-Auswaschbedingungen gab es keinen sichtbaren Defekt in der ACS10cKd-Linie. FAs aus infizierten Erythrozyten wurden extrahiert und einer Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektion (GC-FID) unterzogen; Die Ergebnisse wurden auf die Gesamt-FA normalisiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD von drei biologischen Replikaten für relevante Fettsäuren. b 3D7 und ACS10M300I_C wurden auf junge Trophozoiten angereichert und 10 Stunden lang 10 mM MMV665924 oder DMSO ausgesetzt, wonach FAs extrahiert und mittels GC-FID analysiert wurden. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD von vier biologischen Replikaten für relevante FAs. Beim Signifikanztest wurde ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test verwendet, a: p = 0,006, b: p = 0,03, c: p = 0,02, d: p = 0,01. Die vollständigen Daten für den GC-FID sind in den Zusatzdaten 7 und 8 verfügbar. aTc Anhydrotetracyclin, FA-Fettsäure.

Als nächstes testeten wir, ob die Behandlung mit einer der Verbindungen die FA-Zusammensetzung in infizierten Erythrozyten direkt verändert. Bei der Behandlung von 3D7-Parasiten mit MMV665924 kam es zu einer signifikanten Reduzierung der Alpha-Linolsäure (18:3n-3c), Linolsäure (18:2n-6cc) und cis-Vaccensäure (18:1n-7c) (20, 18). bzw. 45 % Reduktion, p < 0,05 ungepaarter Student-t-Test, Abb. 7b) und ein signifikanter (28 %) Anstieg der Heptadecansäure (17:0) (Supplementary Data 8). Im Gegensatz dazu beobachteten wir bei der Behandlung der resistenten ACS10M300I_C-Linie mit MMV665924 einen Anstieg der Arachidonsäure um 16 % (20:4n-6c), aber keine signifikante Verringerung eines spezifischen FA (p < 0,05 ungepaarter Student-t-Test, ergänzende Daten 8). . Alpha-Linolsäure und Pansensäure (18:2n-7ct) waren in der unbehandelten ACS10M300I_C-Linie im Vergleich zu 3D7 signifikant reduziert (12 bzw. 46 %, Abb. 7b und ergänzende Daten 8). Wie in den Knockdown-Experimenten waren FAs mit einer Kettenlänge von 18 Kohlenstoffatomen am stärksten betroffen.

P. falciparum-Parasiten können ein begrenztes Wachstum in „Minimalmedien“ aufrechterhalten, die im Wesentlichen frei von FAs sind, mit Ausnahme von Palmitinsäure (16:0) und Ölsäure (18:1n-9c)44,45. Wir haben getestet, ob die Ergänzung von Minimalmedien mit einigen der durch MMV665925 am stärksten reduzierten FAs das Überleben des Parasiten unter der Behandlung mit MMV665924 verändern könnte. Tatsächlich erhöhte die Zugabe von Linolsäure (18:2n-6cc) und cis-Vaccinsäure (18:1n-7c) den EC50 im Vergleich zu Minimalmedien signifikant (zweifach) (ergänzende Abbildung 4, p < 0,05 bei gewöhnlichem Ein- Weg-ANOVA im Vergleich zum Wachstum in Minimalmedien, gefolgt von Dunnett-Posttest). Die Zugabe von Myristinsäure (14:0), Palmitoleinsäure (16:1n-7c) oder Stearinsäure (18:0) hatte keinen signifikanten Einfluss auf den EC50 von MMV665924. Diese Daten legen nahe, dass die Bildung von Linolsäure und cis-Vaccinsäure tatsächlich durch MMV665924 gehemmt werden könnte und eine exogene Quelle das Parasitenwachstum stoppen kann.

Plasmodium-Parasiten verändern während ihres asexuellen Lebenszyklus die Lipidzusammensetzung ihrer intrazellulären Umgebung und erhöhen insbesondere die Menge an natürlichen Lipiden (Diacylglycerine (DAGs) und Triacylglycerine (TAGs)) in den infizierten roten Blutkörperchen21. Um zu untersuchen, welche Lipidspezies von der medikamentösen Behandlung betroffen waren, verwendeten wir eine Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse (LC-MS). Wir haben insgesamt 996 Lipidspezies entdeckt, die in 27 verschiedene Unterklassen unterteilt werden konnten (Ergänzende Abbildung 5 und Ergänzende Daten 9). Insgesamt beobachteten wir in beiden mit Medikamenten behandelten Parasitenproben im Vergleich zu mit DMSO scheinbehandelten Kontrollen (MMV665924 bzw. MMV897615, ungepaarter Student-t-Test p <) eine signifikante Reduzierung der TAGs um 20–24 % und einen Anstieg der Phosphatidsäure um 40–45 % 0,05, Abb. 8). Die Behandlung mit beiden Verbindungen löste eine ähnliche Reaktion aus (ungepaarter Student-t-Test p < 0,05, ergänzende Abbildung 6 und ergänzende Daten 10).

Junge 3D7-Trophozoiten wurden basierend auf ihrer magnetischen Bindung an MACS-Säulen angereichert und 8 Stunden lang mit DMSO, 10 mM MMV665924 oder 1 mM MMV897615 behandelt. Die Lipide wurden extrahiert und der Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) unterzogen. Es wurden drei biologische Replikate durchgeführt und die Ergebnisse jeder Probe auf die Gesamtlipidzusammensetzung der Probe normalisiert. Vulkandiagramme, die Lipidspezies für DMSO-behandelte Parasiten im Vergleich zu MMV665924 (a) oder MMV897615 (b) zeigen. Lipidspezies, die mehr als zweifach unterschiedlich sind und einen ap-Wert <0,05 (zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test) haben, sind schattiert. c Veränderungen relevanter Lipidunterklassen bei medikamentöser Behandlung im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. d Der Beitrag jeder einzelnen FA-Art zum gesamten TAG-Pool wurde analysiert und zwischen der DMSO-Kontrolle und den mit Medikamenten behandelten Parasiten verglichen. Es werden Daten für die sechs am häufigsten erkannten FAs angezeigt. Die Ergebnisse wurden aus drei biologischen Replikaten erhalten und sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Unterschiede wurden mithilfe eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests getestet. a: p = 0,01, b: p = 0,006, c: p = 0,00009, d: p = 0,001, e: p = 0,04, f: p = 0,0002, g: p = 0,0003, h: p = 0,004, i: p = 0,003, j: p = 0,0008, k: p = 0,002, l: p = 0,008. Die vollständigen Daten sind in den Zusatzdaten 9 und 11 sowie in der Quelldatendatei verfügbar. FA-Fettsäure, TAG-Triacylglycerin.

TAGs haben drei FA-Einheiten und wir haben den Beitrag jeder einzelnen FA-Spezies analysiert, die im gesamten TAG-Pool nachgewiesen wurde. Nur sechs FA-Arten (18:1 16 %, 16:0 10 %, 18:0 9 %, 16:1 6 %, 18:2 5 % und 18:3 5 %) machten mehr als die Hälfte des TAG-Pools aus. Wir verglichen den Beitrag dieser sechs FAs von behandelten und unbehandelten Parasiten (Abb. 8d). Interessanterweise waren alle vier 18-Kohlenstoff-FA-Arten in den behandelten Parasiten im Vergleich zur DMSO-Kontrolle deutlich weniger häufig (ungepaarter Student-t-Test p < 0,01), während die Menge an 16-Kohlenstoff-FAs nicht beeinflusst wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit den GC-FID-Daten überein, bei denen wir auch die größte Reduzierung bei FAs mit 18 Kohlenstoffatomen beobachteten. Diese kombinierten Daten legen nahe, dass die Behandlung mit MMV665924 oder MMV897615 den Einbau von 18-Kohlenstoff-FA in neu gebildete TAGs hemmt.

Um die biologische Aktivität von MMV019719, MMV665924 und MMV897615 bei Parasiten im asexuellen Blutstadium weiter zu untersuchen, haben wir das Lebensstadium bestimmt, in dem die Verbindungen am wirksamsten waren. Wir setzten synchronisierte Parasiten jeder Verbindung für 12-Stunden-Fenster in drei verschiedenen Konzentrationen während eines intraerythrozytischen Zellzyklus aus und maßen die Parasitämie während und im folgenden Zyklus (Abb. 9 und ergänzende Abb. 7 und 8). Alle Verbindungen zeigten die höchste Aktivität gegen Trophozoiten (24–36 Stunden und 36–48 Stunden nach der Invasion) und minimale Aktivität gegen frühe Ringstadien (0–12 Stunden). Parasiten, die 24 Stunden nach der Invasion behandelt wurden, bildeten abnormale Schizonten, die nicht in den nächsten Zyklus übergingen (ergänzende Abbildung 7). Diese Beobachtung steht im Einklang mit den Transkriptwerten von PfACS10 und PfACS11, die in den späteren Stadien der Entwicklung des asexuellen Blutstadiums ihren Höhepunkt erreichen46,47,48 (http://plasmodb.org49,50), wenn der Bedarf an FAs am höchsten ist.

0–6 Stunden alte Parasiten wurden 12 Stunden lang drei verschiedenen Konzentrationen der Verbindung (niedrig, mittel und hoch) ausgesetzt. Vor der Zugabe des Arzneimittels (Beginn) und alle 12 Stunden nach der Arzneimittelexposition wurden Abstriche durchgeführt. Repräsentative Bilder für die Zwischenkonzentration sind in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt. Die Parasitämie wurde alle 12 Stunden und bis in den zweiten Lebenszyklus hinein durchflusszytometrisch gemessen, um lebensfähige Parasiten zu bestimmen, was durch einen Anstieg der Parasitämie angezeigt wurde. Bei der unbehandelten DMSO-Kontrolle sowie bei Parasiten, die nach 0–12 Stunden für MMV665924 und MMV897615 behandelt wurden, ist bei allen getesteten Konzentrationen und bei mittleren und niedrigen Konzentrationen für MMV019719 ein Anstieg der Parasitämie nach 48 Stunden zu beobachten. Die Behandlung mittlerer Konzentrationen führte auch zu einem Anstieg der Parasitenexposition nach 12–24 Stunden. Die Exposition hoher und mittlerer Konzentrationen nach 24 Stunden hemmte das Wachstum fast vollständig. Pro Zeitpunkt wurden 100.000 Zellen gezählt und ein Beispiel der Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Hier zeigen wir, dass Mutationen in PfACS10 und PfACS11, zwei Mitgliedern der Acyl-CoA-Synthetase-Familie in P. falciparum, eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber drei chemisch unterschiedlichen und neuartigen Verbindungen (MMV665924, MMV019719 und MMV897615) verursachen. Es wird vorhergesagt, dass die Mutationen in PfACS10 die FA-Bindungstasche auskleiden, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen die Substratbindung stören könnten. Wir zeigen, dass PfACS10 bei Parasiten im asexuellen Blutstadium durch bedingten Knockdown essentiell ist und zeigen, dass PfACS10 durch TPP direkt mit MMV786519 interagiert. ACS-Enzyme sind für die Aktivierung freier FAs verantwortlich, die für eine Vielzahl biologischer Prozesse benötigt werden, und wir zeigen, dass die medikamentöse Behandlung zu einem verringerten TAG-Spiegel und einer Anreicherung der Lipidvorläufer Phosphatidsäure und DAGs führt. Diese Ergebnisse verdeutlichen eine neue Anfälligkeit des Parasiten, die für die Entdeckung von Malariamedikamenten zugänglich ist21. Der Einsatz von ACS-Inhibitoren als therapeutische Verbindungen wurde bei der Krebsbehandlung51 sowie bei Parasiten wie Giardia52 und Cryptosporidium parvum53 untersucht. Noch wichtiger ist, dass sich der PfACS10-Inhibitor MMV1582367 (GSK701) in einer klinischen Phase-I-Studie zur Behandlung unkomplizierter Malaria befindet (NCT05507970).

Bei P. falciparum ist die PfACS-Genfamilie im Vergleich zu anderen eukaryotischen Organismen erweitert13. Das erweiterte Funktionsrepertoire dieser erweiterten Familie ist nicht vollständig beschrieben, aber frühere Arbeiten, einschließlich eines PiggyBac-Transposon-Screenings, weisen darauf hin, dass PfACS10 ein essentielles Gen ist. Darüber hinaus belegen unsere bedingten Knockdown-Studien direkt die Essenz dieses Gens für das Wachstum asexueller Parasiten in Kulturen.

Mehrere Hinweise deuten darauf hin, dass das PfACS11-Protein eine Rolle bei der Resistenzübertragung über einen Funktionsverlustmechanismus spielt. Allelaustauschstudien zeigen, dass die Mutationen Resistenz verleihen und der bedingte Abbau des PfACS11-Proteins um 80 % (wie zuvor von Summers et al.40 festgestellt) zu einer Resistenz gegen alle drei Verbindungen führte. ACS11cKD-Parasiten, die ohne aTc kultiviert wurden, zeigten eine Wachstumsreduktion von 20 %, was darauf hindeutet, dass PfACS11 in asexuellen Stadien in vitro nicht essentiell ist. Es ist jedoch möglich, dass eine stärkere Reduzierung des Proteinspiegels erforderlich ist, um das Parasitenwachstum zu hemmen, wie für Plasmepsin V54 gezeigt wurde. PfACS11 spielt auch eine Rolle bei der Verleihung einer Resistenz nicht nur gegen die hier beschriebenen Verbindungen, sondern auch gegen Pantothenamide31 und MMV01972140, die auf die Acetyl-CoA-Synthetase abzielen, die Acetat anstelle von FAs aktiviert. Die Markierung des PfACS11-Locus machte Parasiten resistenter gegen MMV665924, MMV019719 und MMV897615 sowie gegen MMV01972140. Für andere Proteine ​​wurde gezeigt, dass die Zugabe von 3'-Aptameren die Proteinspiegel erheblich reduzieren kann, selbst in Gegenwart von 500 nM aTc33. Wir spekulieren, dass der Verlust der PfACS11-Funktion zu einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber diesen Verbindungen führen könnte. Interessanterweise wurde bei der NPARC-Analyse von TPP eine Abnahme der PfACS11-Stabilität in Gegenwart von MMV897615 festgestellt, was auf eine Destabilisierung eines Proteinkomplexes durch direkte Wechselwirkung mit der Verbindung hinweisen könnte. ACS-Enzyme fungieren oft als Dimere14,55,56 und der Western-Blot eines nativen Gels legt nahe, dass PfACS11 tatsächlich ein Homodimer bilden könnte (Abb. 6c). Wir haben keine Beweise dafür gefunden, dass PfACS11 direkt mit einem der anderen zwölf PfACS oder einem anderen Protein interagiert (ergänzende Abbildung 3, ergänzende Daten 6). Insgesamt legen unsere Ergebnisse nahe, dass die Verbindungen zwar direkt mit beiden Enzymen interagieren können, die primäre wachstumshemmende Wirkung von MMV665924, MMV019719 und MMV897615 jedoch auf ihrer Bindung an die FA-Bindungstasche von PfACS10 und nicht auf der Destabilisierung von PfACS11 beruht. PfACS11 ist daher im Hinblick auf seine biologische Funktion interessant, stellt jedoch ein weniger überzeugendes Angriffsziel für Arzneimittel dar, und weitere Studien sind erforderlich, um seine Rolle bei der Resistenz zu verstehen.

Da Resistenz verursachende Mutationen die FA-Bindungstasche von PfACS10 zu bedecken scheinen, schlagen wir vor, dass die Verbindungen die Fähigkeit von PfACS10 beeinträchtigen, freie FAs zu aktivieren. ACSs können eine Vielzahl von FAs aktivieren und sind häufig längenspezifisch für die Acylkette15,16,17,18. Die individuelle ACSL-Expression wurde auch mit den individuellen Acyl-CoA-Spiegeln in Säugetierzellen korreliert57. Wir haben gezeigt, dass ein Abbau von PfACS10 zu einer Verringerung der endogenen Stearin- und Ölsäure – einige der am häufigsten vorkommenden FAs im Parasiten – führt, was auf eine Präferenz von PfACS10 für die C18-FA-Länge hindeutet. Die Behandlung mit MMV665924 führte zu einer Verringerung der Linol-, Alpha-Linol- und cis-Vaccinsäure, die direkt durch Entsättigung von Stearin- und Ölsäure bei Aktivierung durch ein ACS abgeleitet werden kann. Diskrepanzen bei den spezifischen Arten von C18 FA, die sich zwischen Knockdown und medikamentöser Behandlung ändern, könnten auf unterschiedliche Zeitpunkte und Dauer der Störungen zurückzuführen sein. Es ist auch möglich, dass eine Störung von PfACS10 den subzellulären Handel mit FAs verändert, was hier nicht beurteilt werden konnte. Weitere funktionelle Studien von PfACS10 sind erforderlich, um die Substratspezifität und Funktion von PfACS10 zu bestätigen.

Zusätzlich zu den FA-Spezies untersuchten wir auch die Lipidspezies, die am stärksten von den Verbindungen betroffen sind. Die Behandlung früher Trophozoitenparasiten mit MMV665924 oder MMV897615 führte zu einem signifikanten Rückgang der TAGs. Interessanterweise waren die FA-Einheiten, die am meisten an TAGs (18 Kohlenstoffatome) abgereichert waren, auch in der gesamten FA-Analyse durch GC-FID am stärksten betroffen. Eine Rolle von ACS bei der TAG-Bildung wurde in Prostatakrebszellen gezeigt, wo der Abbau von ACSL1 zu verringerten TAG-Spiegeln führte57. Durch Dephosphorylierung von Phosphatidsäure entsteht DAG, das dann durch Zugabe eines Acyl-CoA in TAG umgewandelt werden kann. Wir beobachteten einen Anstieg der Phosphatidsäuren und DAGs, was eine direkte Folge der Abnahme der TAGs sein könnte. Es wurde gezeigt, dass Phosphatsäure eine wichtige Rolle bei der Lipidhomöostase und der Bildung von Lipidtröpfchen spielt58. Eine Reduzierung der TAGs spät in der Entwicklung des asexuellen Blutstadiums könnte zu weniger Lipidtröpfchen im Parasiten führen, was zu einem Mangel an gespeicherten FAs führen würde, die für zelluläre Prozesse, einschließlich der Bildung von Membranvorläufern für die Bildung von Merozoiten während der Schizogonie, benötigt werden. Tatsächlich bilden Parasiten im Spätstadium, die mit einer der drei Verbindungen behandelt wurden, keine richtigen Merozoiten, was auf einen Defekt in der Membranbildung hinweist.

Unsere Arbeit hier präsentiert PfACS10 als neuartiges Ziel für Malariamittel, das jedoch potenziell Resistenzrisiken birgt. Wir beobachteten ein hohes Maß an genetischer Variation und Divergenz innerhalb und zwischen PfACS10 in den Genomen von P. falciparum-Parasitenpopulationen aus verschiedenen geografischen Regionen, was darauf hindeutet, dass dieser Ort möglicherweise anfällig für Selektion ist, falls in Zukunft spezifische Inhibitoren eingesetzt werden. Tatsächlich wurde erwartet, dass mehrere nicht-synonyme Varianten innerhalb der vorhergesagten Substrat- (und Verbindungs-)Bindungsstellen von PfACS10 auftreten, einschließlich des Vorhandenseins der M300I-Variante, die in Malawi mit hoher Allelfrequenz gefunden wird. Malawi-Isolate, die diese Variation tragen, zeigten phänokopisch die Resistenzniveaus gegen MMV665924, die in den Linien ACS10M300I_S und ACS10M300I_C beobachtet wurden. Um jedoch die Rolle von M300I bei der Resistenz gegen MMV665924 in malawischen Isolaten schlüssig zu beweisen, ist eine Umwandlung der M300I-Mutation in WT in malawischen Isolaten durch CRISPR/CAS9-Editierung erforderlich. PfACS10-Variationen wurden nicht mit aktuellen oder früheren Antimalariatherapien in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass der Ort möglicherweise aufgrund wirtsbezogener Faktoren (Mensch oder Mücke), wie z. B. dem Stoffwechsel, unter Selektionsdruck steht. Allerdings wurden in PfACS11 in natürlichen Parasitenpopulationen nur sehr wenige Mutationen beobachtet. Dies könnte darauf hindeuten, dass PfACS11 im Feld keiner diversifizierenden Selektion unterliegt oder dass seine Funktion konservierter ist und für die Übertragung in der Mücke oder für das Überleben im Leberstadium von wesentlicher Bedeutung sein könnte.

Auch die genetische Vielfalt von PfACS10 und seine Fähigkeit, Mutationen zu tolerieren, könnten vorteilhaft genutzt werden. Mutationen in PfACS10 in zwei Parasitenlinien, die mit MMV897615 selektiert wurden, waren entweder 2,5-fach empfindlicher gegenüber MMV665924 oder 8,5-fach empfindlicher gegenüber MMV019719 (ACS10A268V_S bzw. ACS10A268D_S). Dieses Phänomen erinnert an die Kollateralsensitivität, bei der eine Resistenz gegen ein Medikament die Anfälligkeit für ein anderes erhöht, wie bei Bakterien gezeigt wurde (Übersicht in 59) und bei der Krebsbehandlung untersucht wird60. Kollaterale Empfindlichkeit wurde bei P. falciparum auch für Dihydroorotat-Dehydrogenase-61 und Proteasom-Inhibitoren9,62 sowie für Dihydrofolat-Reduktase-Inhibitoren bei P. vivax63 gezeigt. Die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verwendung verschiedener PfACS10-Inhibitoren könnte das Auftreten von Resistenzen verringern oder resistente Parasiten wirksamer abtöten, was dieses Enzym zu einem wünschenswerten Ziel macht.

MMV019719, MMV665924 und MMV897615 waren als Teil der Malaria-Box von Medicines for Malaria Venture (MMV) frei verfügbar. Triacsin C wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Ref. T4540) gekauft. Der Stamm 3D7 P. falciparum wurde ursprünglich über MR4 als Teil des BEI Resources Repository, NIAID, NIH: 3D7, MRA-102, hinterlegt von DJ Carucci, erhalten. Wir verwendeten auch 3D7-IG06 (einen schnell wachsenden 3D7-Klon)64, gespendet von Daniel Goldberg, und Dd2-Polδ23, gespendet von Marcus Lee. Die Malawi-Parasiten (CF04.008 10B und CF04.009 6D und 1 G, zwei verschiedene Patientenisolate, die nach Kulturanpassung subkloniert wurden) wurden freundlicherweise von Danny Milner26 gespendet. Die Parasiten wurden nach Standardmethoden65 in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 28 mM NaHCO3, 25 mM HEPES, 400 μM Hypoxanthin, 25 μg/ml Gentamicin und 0,5 % AlbuMAX II (Life Technologies, Carlsbad, CA 11021-045), kultiviert. Die menschlichen Erythrozyten stammten aus ethischen Gründen und ihre Forschungsverwendung entsprach den Bedingungen des genehmigten Protokolls.

Für die Transfektion von 3D7-Elternlinien wurden zwei Arten von Plasmiden erzeugt. Der pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR-Vektor66 wurde verwendet, um einen spezifischen Doppelstrangbruch und einen pGEM-3z-Vektor (Promega, Madison, WI, USA) mit der Homologieregion zu erzeugen, die den interessierenden Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) enthielt verschlüsselte Guide-RNAs (gRNAs) als Reparaturvorlage. gRNAs wurden unter Verwendung von Benchling (Benchling, Inc.) entworfen und als Primer bei Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa, USA) mit Überhängen bestellt, die mit den BbsI-Überhängen in pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR kompatibel sind. Das Plasmid pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR wurde mit BbsI verdaut und mit den angelagerten gRNAs ligiert. Um das Reparatur-Template-Plasmid zu erzeugen, wurden etwa 500 Basenpaare rund um den interessierenden SNP aus gDNA von 3D7-Parasiten amplifiziert und mit HincII in den pGEM-3z-Vektor ligiert. Das interessierende SNP und das Scrambling der gRNAs wurden mit dem Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingeführt. Sorbitsynchronisierte Parasiten im Ringstadium wurden unter Verwendung eines Bio-Rad Gene Pulser (Biorad, Hercules, CA) und Bedingungen von 0,31 kV und 960 µF mit insgesamt 100 μg Plasmidtemplate und zwei pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR-Plasmiden elektroporiert zwei verschiedene gRNAs in unvollständigem Zytomix unter Verwendung einer 0,2-cm-Küvette. Die resultierenden transfizierten Parasitenlinien wurden durch limitierende Verdünnung kloniert und mittels Sanger-Sequenzierung sequenziert, um eine erfolgreiche Genbearbeitung zu bestätigen. Die Sequenzen der verwendeten gRNAs und Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 angegeben.

In-vitro-Arzneimittelempfindlichkeiten von Parasiten im asexuellen Blutstadium wurden mithilfe eines auf SYBR Green I (Life Technologies, S7567) basierenden Zellproliferationstests67 bestimmt. Zwölfpunktkurven-Verdünnungsreihen der Testverbindung wurden dreifach am selben Tag durchgeführt und an mindestens drei verschiedenen Tagen wiederholt. Die EC50-Werte wurden mithilfe der nichtlinearen Regressionskurvenanpassung in Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) berechnet.

Zur Ergänzung von Minimal-FA-Studien wurden Parasiten in Minimalmedium resuspendiert, das durch Ergänzung von RPMI-1640 mit 0,39 % fettsäurefreiem BSA und Öl- und Palmitinsäure (jeweils 30 μM; hinzugefügt aus 30 mM Ethanol-gelösten Vorräten; alle aus Sigma-Aldrich). Linolsäure, cis-Vaccinsäure, Myristinsäure, Palmitoleinsäure und Stearinsäure wurden jeweils zu 30 μM hinzugefügt (zugegeben aus 30 mM Ethanol-gelösten Stammlösungen, alle von Sigma-Aldrich).

Der EC50-Wert wurde zunächst auf 32,7 nM in P. falciparum Dd2-Polδ23 bestimmt. Eine einstufige Selektion wurde unter Verwendung klonaler 1E9 Dd2-Polδ-Parasiten im Duplikat bei einer Ausgangskonzentration von 3 x EC50 (98 nM) durchgeführt. Der Arzneimitteldruck wurde schrittweise erhöht, wenn die Parasiten in der ursprünglichen Konzentration gesund blieben. Am 7. Tag erreichte der Arzneimitteldruck seinen höchsten Wert (198 nM) und die Parasiten verschwanden. Kurz darauf, am 14. Tag, traten in beiden Flaschen erneut Parasiten auf. Diese Parasiten wurden während der Kultivierung unter der maximalen Arzneimitteldosis gehalten.

Um den EC50-Wert von Parasiten zu bestimmen, wurden Kulturen im Ringstadium mit 0,2 % Parasitämie und 1 % Hämatokrit 72 Stunden lang einem Bereich von zehn Arzneimittelkonzentrationen ausgesetzt, die zusammen mit DMSO-Kontrollen zweifach seriell in Duplikaten verdünnt wurden. Das Überleben der Parasiten wurde mittels Durchflusszytometrie auf einem iQue-Durchflusszytometer (Sartorius) unter Verwendung von SYBR Green und MitoTracker Deep Red FM (Life Technologies) als Kernfärbung bzw. Vitalfarbstoffen bewertet.

Die Sequenzierung des gesamten Genoms für MMV897615 ausgewählte klonale Parasiten wurde mit dem Nextera Flex DNA-Bibliothekskit durchgeführt und auf einer MiSeq-Durchflusszelle gemultiplext, um 300-bp-Paired-End-Reads zu generieren. Die Sequenzen wurden mithilfe des Burrow-Wheeler-Alignments (BWA-Version 0.7.17) an das Pf3D7-Referenzgenom (PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7; https://plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/fasta/) angepasst. PCR-Duplikate und nicht zugeordnete Lesevorgänge wurden mit Samtools (Version 1.13) und Picard MarkDuplicates (GATK-Version 4.2.2) herausgefiltert. Die Basisqualitätswerte wurden mit GATK BaseRekalibrator (GATK Version 4.2.2) neu kalibriert. GATK HaplotypeCaller (GATK Version 4.2.2) wurde verwendet, um alle möglichen Einzelnukleotidvarianten in Testparasitenlinien zu identifizieren, die auf der Grundlage von Qualitätswerten gefiltert wurden (Variantenqualität als Funktion der Tiefen-QD > 1,5, Kartierungsqualität > 40, minimaler Basisqualitätswert > 18, Lesetiefe > 5), um qualitativ hochwertige SNPs zu erhalten, die mit SnpEff Version 4.3t68 annotiert wurden. BIC-Seq Version 1.1.269 wurde verwendet, um Kopienzahlvarianten (CNVs) gegen den Elternstamm mithilfe des Bayes'schen statistischen Modells zu entdecken. SNPs und CNVs wurden mit dem Integrative Genome Viewer (IGV) visuell untersucht und bestätigt. Alle Genanmerkungen in der Analyse basierten auf PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7 (https://plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/gff/).

Diversitätsberechnungen für Gene in Senegal und Malawi wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt70. Kurz gesagt, genomweite SNP-Aufrufe wurden vom Pf3k-Projekt erhalten (Version 5; www.malariagen.net/projects/pf3k). Basierend auf den heterozygoten Call-Raten (entweder ≥2 % heterozygote Calls oder ≥4 % fehlende Calls) wurde festgestellt, dass 99 Senegal- und 110 Malawi-Proben von Einzelkloninfektionen stammten und für die nachgelagerte Analyse aufbewahrt wurden. Varianten innerhalb dieser Proben wurden maskiert, wenn sie einen GATK-Filter nicht bestanden hatten, in >25 % der Proben fehlten oder bei einzelnen Infektionen ein hohes Maß an Heterozygotie aufwiesen (>25 %). Darüber hinaus versagten 558 Gene bei Qualitätsfiltern auf Genebene (≥20 % heterozygote Aufrufe oder ≥20 % fehlende Aufrufe in allen Proben) und wurden aus der Analyse entfernt. Berechnungen der paarweisen Nukleotiddiversität (π) und des FST-Schätzers von Weir und Cockerham wurden mit dem PfalGeneDiversityStats-Paket71 durchgeführt.

Strukturvorhersagen der PfACS10- und PfACS11-Proteine ​​wurden aus der AlphaFold-Datenbank27,72, AlphaFold DB Version 2022-06-01, erstellt mit der AlphaFold Monomer v2.0-Pipeline, erhalten. Der AlphaFold-Algorithmus berücksichtigt evolutionäre, physikalische und geometrische Einschränkungen mithilfe neuronaler Netzwerkarchitekturen, um Proteinstrukturen vorherzusagen. Bilder wurden mit Pymol 2.5.3 gerendert.

Um die Donorvektoren für die induzierbare Regulierung der PfACS10-Expression (PF3D7_0525100) zu erzeugen, wurden die rechten Homologieregionen (RHR) durch PCR unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Primer amplifiziert und zusammen mit den linken Homologieregionen (LHR) und einzelnen gRNA-Fragmenten mithilfe von synthetisiert Das BioXP™ 3200-System (SGI-DNA, San Diego, CA) wurde in den auf dem pJazz-System basierenden Vektor pSN05473 kloniert. Zu den Merkmalen dieses Vektors gehören (i) C-terminale Epitop-Tags V5 und 2x-Hämagglutinin (HA) im Leserahmen des Zielgens, gefolgt von einem 10x-Aptamer-Array; (ii) eine TeTR-DOZI-Kassette, die die Blasticidin-S-Desaminase zur Selektion in den Parasiten, das Reportergen Renilla-Luciferase (RLuc) und die regulatorischen Fusionsproteine ​​TetR-DOZI enthält, die alle unter dem PfHsp86-Promotor und dem PfHrp2-Terminator exprimiert werden; und (iii) eine gRNA-Expressionskassette mit T7-Promotor und -Terminator. Die Generierung des Donorvektors erfolgte über Gibson-Assemblierung, und das endgültige Konstrukt wurde sequenzverifiziert und durch Restriktionsverdaus weiter bestätigt.

Die Transfektion in Parasiten erfolgte durch Vorbeladung der Erythrozyten mit dem linearen Vektor ACS10_pSN054, wie zuvor beschrieben74. Kurz gesagt, 50 μg gereinigte Plasmid-DNA wurden mit menschlichem Erythrozyten gemischt und 8 Rechteckwellen-Elektroporationsimpulsen von 365 V für jeweils 1 ms im Abstand von 0,1 s in einer 0,2-cm-Küvette ausgesetzt. Die mit Plasmid-DNA vorbeladenen Zellen wurden mit NF54-exprimierender Cas9- und T7-RNA-Polymerase inokuliert, in 500 nM Anhydrotetracyclin (aTc, Ref.-Nr. 37919 Sigma-Aldrich) gehalten und mit 2,5 μg/ml Blasticidin (Ref.-Nr. B12150-0.1 RPI Corp.) medikamentös selektiert , Mt. Prospect, IL) wurde vier Tage nach der Transfektion begonnen. Das Auftreten transfizierter Parasiten wurde mittels Giemsa-Abstrichen und RLuc-Messungen überwacht. Obwohl Transfektionen mit ACS10_pSN054 zunächst fehlschlugen, führte die Entfernung der Epitop-Tags zu erfolgreichen Transfektionen.

Die Beurteilung der Parasitenproliferationsrate über zwei intraerythrozytäre Entwicklungszyklen durch Titration der Expression von PfACS10 und YFP erfolgte, indem die Kulturen in unterschiedlichen aTc-Konzentrationen gehalten wurden und die Lumineszenz als Messwert für das Wachstum verwendet wurde. In einer 96-Well-BD-Falcon™-Platte mit U-Boden wurden Parasiten im synchronen Ringstadium dreifach angelegt und in Gegenwart (50 und 3 nM) oder Abwesenheit von aTc kultiviert. Die Expansion wurde bei 0, 72 und 120 Stunden durch Quantifizierung der Lumineszenz mit dem Renilla-Glo(R) Luciferase Assay System (Ref.-Nr. E2750, Promega) und dem GloMax® Discover Multimode Microplate Reader (Promega) gemessen. Die Lumineszenzwerte wurden auf mit Chloroquin behandelte (200 nM) Proben normalisiert und die Ergebnisse wurden in einem Streudiagramm mit GraphPad Prism (Version 8; GraphPad Software) visualisiert.

Synchronisierte ACS11cKD-Parasiten wurden 40 Stunden nach der Invasion pelletiert und 15 Minuten lang in 0,03 % Saponin in 1 × PBS bei 4 °C resuspendiert. Die Pellets wurden viermal in 10 Volumina kaltem PBS mit Proteaseinhibitor gewaschen und in PBS mit Proteaseinhibitor (Ref.-Nr. 4693159001, Sigma) resuspendiert. Die Hälfte der Probe wurde in ein neues Röhrchen überführt und mit jeweils 10 μM MMV665924 und MMV019719 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Hälfte jeder Probe wurde erneut in ein neues Röhrchen gegeben und nur mit Laemmli-Puffer (Ref.-Nr. 1610737, BioRad) für nicht reduzierende Bedingungen oder Laemmli-Puffer mit 2-Mercaptoethanol für reduzierende Bedingungen gemischt. Proteinproben wurden auf Mini-PROTEAN® TGX™ Fertiggelen (4–20 % Gradient, BioRad) entweder nur in Tris-Glycin-Puffer (nicht reduzierend) oder mit SDS für reduzierende Bedingungen getestet. Durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennte Proteine ​​wurden unter Verwendung des iBlot-Systems (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine Nitrozellulosemembran (Life Technologies, IB3010-31) übertragen und über Nacht mit Intercept® (TBS) Blocking Buffer (LI-COR Biosciences) blockiert . Membrangebundene Proteine ​​wurden mit Maus-Anti-HA- (1:1000; Sigma-Aldrich, H3663) und Kaninchen-Anti-H3-Primärantikörpern (1:1000 Histon H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb, Cell Signaling Technology, 4499 S) untersucht und Anti-Maus- (IRDye® 680RD Ziegen-Anti-Maus, 926-68070, LI-COR) und Anti-Kaninchen- (IRDye® 800CW Ziegen-Anti-Kaninchen, 926-32211, LI-COR) Sekundärantikörper. Protein-Blots wurden mit dem LI-COROdyssey CLx Imager System (LI-COR Biosciences) und Image Studio™ Lite (Version 5.2.5) abgebildet und analysiert.

Für Co-Immunpräzipitationsstudien wurden ACS11cKD-Parasiten (250 ml bei 3 % Parasitämie und 5 % Hämatokrit) mit Sorbitol synchronisiert, gewaschen und entweder in Gegenwart (500 nM) oder in Abwesenheit von aTc gezüchtet und im Schizontenstadium gesammelt (32). –42 Stunden nach der Invasion). Bei der Entnahme wurden die Erythrozyten in 0,05 % Saponin in PBS mit EDTA-freiem Proteaseinhibitor-Cocktail (cOmplete mini, Sigma) lysiert und mit PBS einschließlich Proteaseinhibitoren gewaschen, um restliches Erythrozytenmaterial zu entfernen. Parasitenpellets wurden in RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, EDTA-freie vollständige Mini-Proteaseinhibitoren (Ref.-Nr. 4693159001, Sigma) lysiert ) für 1 Stunde, dreimal alle 3 Minuten für 30 Sekunden mit 25 % Amplitude beschallt und 30 Minuten lang bei 12.000 g geschleudert, um den Überstand als lösliches Protein zu sammeln. Proteinlösungen wurden auf 40 μl Anti-HA-Magnetkügelchen aufgetragen (Ref Nr. 88836, Pierce) und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden viermal mit RIPA-Puffer und anschließend viermal mit 50 mM Ammoniumbicarbonat gewaschen, in 40 μl Ammoniumbicarbonat resuspendiert und einer On-Bead-Verdauung gefolgt von einem Peptid unterzogen Identifizierung mittels LC–MS/MS.

Für TPP-Experimente wurden die Kulturen bei täglichem oder zweimal täglichem Medienwechsel auf einem Hämatokritwert zwischen 1,5 und 2,0 % gehalten. Sobald die Kulturen einen Parasitämiewert von 8–15 % erreichten und späte Trophozoiten waren, wurden infizierte Erythrozyten durch MACS-Trennung unter Verwendung eines SuperMACS II-Magneten in Verbindung mit einer D-Säule (Miltenyi Biotec) isoliert. Eluatpellets wurden in 10 ml Vollmedium resuspendiert und in Arzneimittel bei 10 × EC50 oder Verdünnungsmittel (DMSO) 1 Stunde lang bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre aus 1 % O2, 3 % CO2 und einem Rest N2 inkubiert. Der Arzneimitteldruck wurde während der restlichen Probenverarbeitung aufrechterhalten. Nach der Zentrifugation wurden parasitierte Erythrozyten durch 10-minütige Inkubation in 0,1 % (Gew./Vol.) Saponin auf Eis unter leichtem Mischen lysiert. Das Pellet wurde dreimal in Waschpuffer (WB; 100 mM Kaliumacetat, 2,5 mM Magnesiumacetat, 45 mM HEPES [pH 7,4], 250 mM Saccharose, 2 mM Dithiothreitol, 15 µM Leupeptin) gewaschen, um lysiertes rotes Blutkörperchenmaterial zu entfernen. Das Pellet wurde in einem Volumen WB, ergänzt mit 0,8 % (v/v) n-Octylglucosid und Proteaseinhibitor (Roche cOmplete EDTA-freier Proteaseinhibitor; 1 Tablette/20 ml), resuspendiert und die Parasiten durch Stickstoffkavitation (Parr) lysiert ( 4 °C, 1500 psi, 60 Min.). Das resultierende Lysat wurde zentrifugiert (100.000 × g, 20 Min., 4 °C), der Überstand geerntet und die Proteinkonzentration des Lysats mit dem Bio-Rad Protein Assay bestimmt.

TPP-Tests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt75. In diesem Fall wurden die Lysate jedoch acht Temperaturen ausgesetzt: 37, 42, 47, 52, 57, 62, 67 und 72 °C.

Der Proteinverdau wurde wie zuvor beschrieben75 durchgeführt. Anschließend wurden die Proben vakuumgetrocknet und in 100 mM TEAB (100 µL) resuspendiert, bevor sie mit ihren jeweiligen Tandem Mass Tag™ (TMT pro) 16-Plex-Reagenzien (Thermo) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert wurden. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 5 % (v/v) Hydroxylamin für 15 Minuten gelöscht, und jeder Satz Proben (behandelt und Vehikel) wurde dann gepoolt und über Nacht getrocknet. Die TMT-markierten Proben wurden wie zuvor beschrieben75 getrocknet und entsalzt und dann bis zur weiteren Analyse bei –80 °C aufbewahrt. Die Probenfraktionierung wurde wie zuvor beschrieben75 durchgeführt, jedoch mit einem anderen, an TMT-pro-markierte Peptide angepassten Gradienten: 2 % Puffer B auf 20 % B in 8 Minuten, dann von 20 % B auf 40 % B in 37 Minuten. Die Säule wurde 15 Minuten lang mit 100 % Puffer B gewaschen und 20 Minuten lang mit 2 % Puffer B erneut äquilibriert.

Die Analyse der Peptide wurde mit einem Orbitrap Eclipse (Thermo Scientific)-Massenspektrometer durchgeführt, das an ein Dionex Ultimate 3000 RS (Thermo Scientific) gekoppelt war. Die Online-HPLC wurde wie zuvor beschrieben75 durchgeführt. Orbitrap Eclipse wurde im datenabhängigen Modus verwendet. Ein Scanzyklus umfasste einen MS1-Scan (m/z-Bereich von 380–1500, mit einer automatischen maximalen Ioneninjektionszeit, einer Auflösung von 120.000 und einem Standardzielwert für die automatische Verstärkungsregelung) gefolgt von sequentiell abhängigen MS2-Scans (mit einer Isolierung). Fenster auf 0,7 Da eingestellt, maximale Ioneninjektionszeit bei 50 ms und Standard-AGC-Ziel) und MS3-Scans (mit einer Auflösung von 50.000, einem Isolationsfenster auf 0,7 Da eingestellt, maximale Injektionszeit bei 120 ms und 400 % AGC-Ziel). Während der Analyse war die Echtzeit-Suchfunktion aktiv.

Die Analyse der resultierenden MS-Daten wurde mit der Software MaxQuant (http://maxquant.org/, Version 2.0.3.0) durchgeführt. Änderungen, Verdauungen und Datenbanksucheinstellungen erfolgten wie zuvor beschrieben. Der Reporterionen-MS3-Modus wurde mithilfe der TMT-16plex-Markierungen am N-Terminus und Lysin ausgewählt. Die FTMS-MS/MS-Massentoleranz wurde auf 10 ppm und die ITMS-MS/MS-Massentoleranz auf 0,5 Da eingestellt.

TPP-Experimente wurden mit dem in Bioconductor verfügbaren TPP-Paket analysiert, wie zuvor beschrieben39,75,76. Kurz gesagt, die Rohproteinhäufigkeit, berechnet aus den normalisierten Reporterionenintensitäten aller quantifizierten Proteine, wurde für jede Bedingung und jedes Replikat auf die Proteinhäufigkeit bei der niedrigsten Temperatur normalisiert. Schmelzkurven wurden mithilfe eines sigmoidalen Anpassungsalgorithmus im R-Programm des TPP-Pakets berechnet. Mithilfe dieser Anpassung wurde der Schmelzpunkt (Tm) bestimmt, der als die Temperatur definiert ist, bei der die Hälfte des Proteins denaturiert wurde. Die Schmelzpunktunterschiede (ΔTm) wurden durch Subtrahieren der Tm-Werte der behandelten und unbehandelten Probe berechnet. Die sigmoidalen Schmelzkurven wurden nach folgenden Kriterien gefiltert: Die Schmelzkurven müssen ein relatives Häufigkeitsplateau <0,3 erreichen und der Korrelationskoeffizient (R2) muss >0,8 sein. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines Z-Tests berechnet und nur Proteine ​​mit einem p-Wert < 0,2 in beiden technischen Replikaten wurden als Treffer gewertet. In zwei biologischen Replikaten gefundene Treffer galten als mutmaßliche Ziele. Alternativ verwendeten wir die NPARC-Methode (nichtparametrische Analyse von Reaktionskurven), eine Strategie, die die experimentellen Daten mit zwei Modellen vergleicht: einem Nullmodell, das davon ausgeht, dass das Medikament keinen Einfluss auf das Proteinschmelzverhalten hat, und einem alternativen Modell, das davon ausgeht Dieses Medikament beeinflusst das Schmelzverhalten. Alle datengesteuerten Anpassungen dieser Modelle wurden berechnet und mithilfe eines F-Tests auf statistische Signifikanz bewertet, wodurch ein p-Wert generiert wurde. Alle mit MMV897615 generierten TPP-Datensätze wurden über das PRIDE-Partner-Repository77 unter der Kennung PXD034937 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

Um festzustellen, ob die Behandlung von Parasiten mit MMV665924 einen Einfluss auf die FA-Zusammensetzung hatte, wurden etwa 32 Stunden nach der Invasion hochsynchronisierte 3D7-Wildtyp- oder ACS10M300I_C-Parasiten unter Verwendung eines quadroMACS™-Magneten mit LD-Säulen (130-042-901, Miltenyi Biotec) isoliert. Anschließend wurden die Parasiten 10 Stunden lang 10 μM MMV665924 in Vollmedium ausgesetzt. Anschließend wurden die Parasiten dreimal mit 1 × PBS gewaschen und zur weiteren Extraktion bei –80 °C gelagert.

Um den kurzfristigen Effekt der Entfernung von PfACS10 zu testen, wurden Parasiten mit den bedingten Knockdown-Linien synchronisiert und aTc etwa 20 Stunden nach der Invasion durch dreimaliges Waschen der Parasiten in unvollständigem RPMI für 5 Minuten abgewaschen. Die Parasiten wurden dann entweder in Medien mit 500 nM aTc (Kontrolle) zurückgeführt oder 24 Stunden lang in Abwesenheit von aTc gezüchtet und anschließend wie oben beschrieben mit einem MACS-Magneten gereinigt. Für jede Probe wurden etwa 108 Zellen eingereicht, die durch Zellzählung auf dem MACSQuant VYB (Milteni Biotec) bestimmt wurden.

Probenextraktion, Chromatographie und Datenanalyse wurden in der GC-FID-Kernanlage der Ernährungsabteilung (Harvard TH Chan School of Public Health, Boston, MA) durchgeführt. Kurz gesagt, die gesamten Lipide wurden aus Erythrozyten in Isopropanol und Hexan extrahiert, die 50 mg 2,6-Di-tert-butyl-p-kresol als Antioxidans enthielten78. FAs wurden wie beschrieben mit Methanol und Schwefelsäure transmethyliert79,80. Nach der Veresterung wurden die Proben eingedampft und die FA-Methylester in Isooctan wieder aufgelöst. Die FAs wurden unter Verwendung eines GC 6890 FID-Gaschromatographen Modell Hewlett-Packard (jetzt Agilent) mit 7673 Autosampler-Injektor (Palo Alto, CA), Splitless-Injektionsanschluss bei 240 °C und einem Wasserstoffträgergas mit konstantem Fluss bei 1,3 ml/min getrennt. 1 μl der Probe wurde in eine Quarzglaskapillar-cis/trans-Säule SP2560, 100 Meter × 250 μm Innendurchmesser × 0,20 μm Film (Supelco, Belefonte, PA) injiziert und einem Temperaturprogramm von 90 bis 170 °C bei 10 °C unterzogen °C/min, 170 °C für 5 min, 170 bis 175 °C bei 5 °C/min, 175 bis 185 °C bei 2 °C/min, 185 bis 190 °C bei 1 °C/min, 190 to 210 bei 5 °C/Min., 210 °C für 5 Min., 210 bis 250 °C bei 5 °C/Min. und 250 °C für 10 Min. Spitzenretentionszeiten wurden durch Injektion bekannter Standards mit Reinheitsbereichen über 99 Prozent (NuCheck Prep, Elysium, MN) und der Analysesoftware Agilent Technologies ChemStation A.08.03 ermittelt. Mit dieser Methodik können insgesamt 45 FAs identifiziert werden.

Für die Lipidprofilierung wurden hochsynchronisierte 3D7-Wildtyp-Parasiten etwa 32 Stunden nach der Invasion mit einem quadroMACS™-Magneten mit LD-Säulen (130-042-901, Miltenyi Biotec) isoliert. Anschließend wurden die Parasiten 8 Stunden lang 10 μM MMV665924 oder 1 μM MMV9897615 in Vollmedium ausgesetzt. Anschließend wurden die Parasiten dreimal mit 1x PBS gewaschen und die Zellzahl auf einem MACSQuant VYB (Milteni Biotec) ermittelt.

Mit Glaspipetten wurden Parasitenpellets in 200 μl dH2O resuspendiert und dann in ein Glasfläschchen (VWR 66011-550) überführt und in 2 ml Methanol homogenisiert. Anschließend wurden vier ml Chloroform zugegeben und die Lösung 1 Minute lang kräftig geschüttelt. 1,8 ml dH2O wurden zugegeben und 1 Minute lang kräftig gevortext. Die Fläschchen wurden 10 Minuten lang bei etwa 3000 rcf zentrifugiert. Die untere Chloroformphase wurde in ein neues Glasfläschchen überführt und bei –80 °C gelagert.

Lipidproben wurden am Harvard Center for Mass Spectrometry analysiert. Die LC-MS-Analysen wurden von Miraldi81 modifiziert und auf einem Orbitrap Exactive plus (Thermo Scientific) in Verbindung mit einem Ultimate 3000 LC (Thermo Scientific) durchgeführt. Jede Probe wurde im positiven und negativen Modus analysiert, im automatischen datenabhängigen MSMS-Modus der Top 5. Die Säulenhardware bestand aus einer Biobond C4-Säule (4,6 × 50 mm, 5 μm, Dikma Technologies). Die Flussrate wurde 5 Minuten lang auf 100 μl min-1 mit 0 % mobiler Phase B (MB) eingestellt und dann 50 Minuten lang auf 400 μl min-1 umgestellt, mit einem linearen MB-Gradienten von 20 bis 100 %. Die Säule wurde dann 8 Minuten lang bei 500 μl min-1 bei 100 % MB gewaschen, bevor sie 7 Minuten lang bei 0 % MB und 500 μl min-1 erneut äquilibriert wurde. Bei Läufen im positiven Modus bestanden die Puffer für die mobile Phase A (MA) aus 5 mM Ammoniumformiat, 0,1 % Ameisensäure und 5 % Methanol in Wasser und für die mobile Phase B (MB) aus 5 mM Ammoniumformiat, 0,1 % Ameisensäure. 5 % Wasser, 35 % Methanol in Isopropanol. Bei negativen Läufen bestanden die Puffer für MA aus 0,03 % Ammoniumhydroxid, 5 % Methanol in Wasser und für MB aus 0,03 % Ammoniumhydroxid, 5 % Wasser, 35 % Methanol in Isopropanol. Lipide wurden mit der Lipidsearch©-Software (Version 4.2.27, Mitsui Knowledge Industry, Universität Tokio) identifiziert und quantifiziert. Integrationen und Spitzenqualität wurden manuell kuratiert, bevor die Daten in Microsoft Excel exportiert und analysiert wurden.

Hochsynchronisierte 3D7-Parasiten wurden für die Dauer des Experiments in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 5 % Hämatokrit in 2 ml Vollmedium kultiviert. Jede Vertiefung wurde 12 Stunden lang zu unterschiedlichen Zeitpunkten dem Arzneimittel oder DMSO im höchsten verwendeten Arzneimittelvolumen (1 μM, 5 μM oder 10 μM für MMV665924 und MMV019719, 100 nM, 500 nM oder 1 μM für MMV897615) ausgesetzt Lebenszyklus (0–12 h, 12–24 h, 24–36 h, 36–48 h) oder während des gesamten Lebenszyklus (0–48 h). Zu jedem 12-Stunden-Zeitpunkt wurden dem Arzneimittel ausgesetzte Parasiten in 10 ml unvollständigem Medium (ohne Albumax II) gewaschen und in vollständigem Medium ohne Arzneimittel resuspendiert, und eine neue Vertiefung mit Parasiten wurde der Arzneimittelbehandlung ausgesetzt. Die Hälfte des Mediums wurde zu jedem Zeitpunkt in allen Vertiefungen entfernt und wieder aufgefüllt, um sicherzustellen, dass den Parasiten genügend Nährstoffe zur Verfügung standen. Jede zuvor freigelegte Vertiefung wurde ausgestrichen und 5 μl wurden mit SYBR Green I für die Durchflusszytometrieanalyse gefärbt. Ein letzter Zeitpunkt wurde 65 Stunden nach Beginn des Experiments ermittelt.

Die Parasiten wurden 30 Minuten lang im Dunkeln bei 37 °C in 10 × SYBR Green I in 1 × PBS gefärbt. Die Färbelösung wurde entfernt und die Zellen wurden im fünffachen Volumen des ursprünglichen PBS-Volumens resuspendiert. Die Erfassung der Durchflusszytometrie-Daten wurde mit einem MACSQuant VYB (Milteni Biotec) mit einem 488-nm-Laser und einem 525-nm-Filter durchgeführt und mit FlowJo 2 analysiert. Erythrozyten wurden anhand der Vorwärts- und Seitenstreuung kontrolliert und infizierte Erythrozyten wurden in Kanal B1 nachgewiesen. Pro Probe wurden mindestens 100.000 Ereignisse analysiert. Ein Beispiel für die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente in mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt. Die EC50-Werte für Dosis-Wirkungs-Kurven wurden mithilfe der nichtlinearen Regressionskurvenanpassung in Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) berechnet. Die Mittelwerte wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Dunnetts Posttest verglichen, wenn mehr als drei Stämme mit einer Kontrolllinie verglichen wurden, und eines zweiseitigen ungepaarten Student-T-Tests, wenn nur zwei Stämme miteinander verglichen wurden (Prisma 7 – 9,5). 0. oder Excel.16.69.1). Es wurden keine statistischen Methoden verwendet, um die Stichprobengröße vorab zu bestimmen, und die Forscher waren hinsichtlich der Stichprobenidentität nicht blind.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

WGS-Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden im Europäischen Nukleotidarchiv (ENA) am EMBL-EBI unter der Zugangsnummer PRJEB57553 hinterlegt. Alle mit MMV897615 generierten TPP-Datensätze wurden über das PRIDE-Partner-Repository (https://www.ebi.ac.uk › Pride)77 unter der Kennung PXD034937 beim ProteomeXchange-Konsortium (https://www.proteomexchange.org) hinterlegt. Alle weiteren Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Die PlasmoDB-Datenbank diente als Referenz für die Annotation und Expression von Genen [https://plasmodb.org]. Die genomweite SNP-Verteilung wurde aus dem Pf3k-Projekt [Version 5; www.malariagen.net/projects/pf3k]. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der für die populationsgenetische Analyse verwendete Code ist zur Wiederverwendung frei verfügbar und kann auf GitHub (https://github.com/amearly/Dantzler_et_al_Diversity_Calcs; https://doi.org/10.5281/zenodo.7613429) und zenodo ( https://zenodo.org/record/7613429#.Y-GYgezML1K)71.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Marcus Lee für die freundliche Spende des pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR-Vektors und der Dd2polδ-Linie sowie Daniel Goldberg für die 3D7_IG06-Linie. Wir danken Terrie Taylor und Karl Seydel für die Sammlung und Verwendung der Malawi-Parasiten-Isolate. Wir danken außerdem Michael D. Barrins und Matthew Brendan Lopes Costa-Rodrigues für die Probenextraktion und Chromatographie für GC-FID-Experimente. Wir möchten uns auch bei Didier Leroy für die Wirkstoffentwicklung und bei MMV und Takeda Pharmaceutical Company Limited für die Bereitstellung von MMV897615 bedanken. Finanzierung: Die Bill and Melinda Gates Foundation gewährt OPP1156051 an DFW und OPP1054480 an EAW. Medicines for Malaria Venture (MMV08/0015) und NIH (R37 AI050234) an DAF.

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Selina Bopp, Robert L. Summers, Pamela Magistrate-Coxen, Allison R. Demas, Angela M. Early, Amanda K. Lukens, Danny Milner, Sarah K. Volkman und Dyann F. Wirth

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Selina Bopp, Robert L. Summers, Pamela Magistrate-Coxen, Allison R. Demas, Angela M. Early, Amanda K. Lukens, Danny Milner, Sarah K. Volkman und Dyann F. Wirth

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SB, CFAP, RLs, PMC, KAS, VCL, SM, SD, SS, ASN, ARD, RM, NW, VC, MGGL und VF führten die Experimente durch, SB, RLS, TY, VC, VF und AME analysierten die Daten , SB, AKL, DM, JF, FJG, EAW, SKV, BL, MD, DAF, SW, JCN und DFW stellten Reagenzien zur Verfügung und/oder konzipierten und konzipierten die Experimente, SB, RLS, EAW, DAF, SW und DFW hat das Manuskript geschrieben. Alle Autoren überprüften und genehmigten die endgültige Fassung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Dyann F. Wirth.

MD und BL sind MMV-Mitarbeiter. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Darren Creek, Koen Dechering und Colin Sutherland für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bopp, S., Pasaje, CFA, Summers, RL et al. Starke Acyl-CoA-Synthetase-10-Inhibitoren töten Plasmodium falciparum, indem sie die Triglyceridbildung stören. Nat Commun 14, 1455 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36921-2

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Eingegangen: 05. Juni 2020

Angenommen: 20. Februar 2023

Veröffentlicht: 16. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36921-2

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